T4 DNA Ligase（Fast）
REF: MD001
储运条件
-20℃ 保存。
产品组成
|
组分/规格
|
MD001S-200 U |
MD001M-1000 U |
|
T4 DNA Ligase (5 U/μl) |
40μl |
200μl |
|
10× T4 DNA Ligase Buffer |
200μl |
1ml |
|
50% PEG |
200μl |
1ml |
注：1 U=1 Weiss unit
产品简介
T4 DNA Ligase（Fast）由携带T4噬菌体gene 30的 大肠杆菌产生。该酶催化双螺旋DNA或RNA之间的5'-磷酸基团和3'羟基之间形成磷酸二酯键。该酶在双链DNA、RNA或者DNA/RNA 复合物间可修复单链缺刻, 并且可以连接有粘性末端或者平末端的 DNA片段，但对于单链核酸无活性，主要用于限制性内切酶酶切产物DNA片段克隆、基因定点突变与PCR产物克隆、修复双链DNA 缺刻与线性DNA自环化。T4 DNALigase需要ATP作为辅助因子，在室温下完成粘性末端连接反应仅需10分钟。
酶活单位定义
37℃条件下，1 Weiss unit的酶在20 min内催化1 nmol的 [32PPi] 转变为活性炭吸附态。1 Weiss unit等同于约200个粘性末端连接反应单位（CEU）1Weiss Unit-200CEU。1CEU相当于在16℃条件下，30 min内连接50% HindIII 消化后的λDNA片段。
酶活检测条件
酶活在如下反应混合物中进行测试：66 mM Tris-HCl (pH 7.6)， 6.6 mM MgCl2，0.066 mM ATP，10 mM DTT，3.3 μM [32PPi]。
质量控制
核酸内切酶残留测试
37℃条件下，将200 U 的 T4 DNA Ligase（Fast） 与 1 μg的pUC19 DNA中温育4 h，未检测出由共价闭合环状DNA转 变为带有缺刻的DNA。
核酸外切酶残留测试
将酶液与双链DNA底物在37℃温育16 h，通过DNA电泳检测双链DNA底物无变化。
蓝白斑测试
室温条件下，使用30 U T4 DNA Ligase（Fast）连接pUC57 DNA/ HindIII，pUC57 DNA/PstI及pUC57 DNA/SmaI消化产物1 h，然后 用E.coli XL1-Blue感受态细胞转化连接产物，检测到少于1%的白斑。
使用方法
1. DNA插入片段连接至载体DNA（粘性末端连接）
①于冰上配制如下反应体系：
|
试剂 |
使用量 |
|
线性化载体DNA |
20~100 ng |
|
插入片段DNA |
1:1~5:1（片段：载体摩尔比） |
|
10× T4 DNA Ligase Buffer |
2μl |
|
T4 DNA Ligase |
1U（0.2μl） |
|
Nuclease-Free Water |
To 20 μl |
②充分混匀并瞬离，22℃温育10 min。
③取1~5 μl的连接产物用于50 μl化学感受态细胞的转化，或者取 1~2 μl用于50 μl电转感受态细胞的转化。
注：如果连接反应产物用于电转化，应使用离心柱或者氯仿抽提清洁DNA 代替热失活步骤。
2. DNA插入片段连接至载体DNA（平末端连接）
①于冰上配制如下反应体系：
|
试剂 |
使用量 |
|
线性DNA |
20~100ng |
|
插入片段DNA |
1:1~5:1（片段：载体摩尔比） |
|
10× T4 DNA Ligase Buffer |
2μl |
|
50% PEG |
2μl |
|
T4 DNA Ligase |
5U（1μl） |
|
Nuclease-Free Water |
To 20 μl |
②充分混匀并瞬离，22℃温育1 h；
③取1~5 μ l的连接产物用于50μ l化学感受态细胞的转化，或者取 1~2μl用于50μ l电转感受态细胞的转化。
注：：如果连接反应产物用于电转化，应使用离心柱或者氯仿抽提清洁DNA 代替热失活步骤。
3. 线性DNA自环化
①于冰上配制如下反应体系：
|
试剂 |
使用量 |
|
线性化DNA |
10~50 ng |
|
10× T4 DNA Ligase Buffer |
5μl |
|
T4 DNA Ligase |
5U（1μl） |
|
Nuclease-Free Water |
To 50 μl |
②彻底混匀并瞬离，22℃温育10 min；
③取1~5μl的连接产物用于50μ l化学感受态细胞的转化，或者取 1~2 μ l用于50 μ l电转感受态细胞的转化。
注：如果连接反应产物用于电转化，应使用离心柱或者氯仿抽提清洁DNA 代替热失活步骤。
4. 接头连接
双链寡核苷酸接头经常被用于在插入片段上产生粘性末端。接头 通常包含限制酶识别位点，在连接后经酶切处理产生和克隆载体匹配的粘端。有时候接头已包含与克隆载体匹配的粘端，此时无需在接头连接完成后进行插入片段的进一步处理。
① 于冰上配制如下反应体系：
|
试剂 |
使用量 |
|
线性化DNA |
100 ~500ng |
|
磷酸化接头 |
1~2μg |
|
10× T4 DNA Ligase Buffer |
2μl |
|
50% PEG |
2μl |
|
T4 DNA Ligase |
2U（0.4μl） |
|
Nuclease-Free Water |
To 20 μl |
②彻底混匀并瞬离，22℃温育10 min；
③在65℃作用10 min或者70℃作用5 min，进行热失活。
注：添加0.5 mM ATP的条件下，T4 DNALigase在伊势久FastCut限制酶切缓冲液中具有100%的活力。因此，接头连接反应时可以在FastCut限制酶切缓冲液中进行，以简化“接头连接-酶切”实验流程。具体方法为：接头连接反应完成后，先失活T4 DNA Ligase，然后向该体系中添加ATP至终浓度0.5 mM，再在体系中加入适量的伊势久快速内切酶，最后使用最适酶切反应温度进行温育即可。
注意事项
1. T4 DNA Ligase（Fast）在浓度高于200 mM的NaCl或KCl中会被强烈抑制；
2. 连接反应液添加量不应该超过感受态细胞体积的10%，不推荐体 系中加入过量的T4 DNA Ligase（Fast）；
3. 与T4 DNA Ligase（Fast）结合的DNA可能会在琼脂糖凝胶中出现带移或弥散，为了避免此现象，可以在上样前对酶进行热失活，必要时加入适量的SDS；
4. 聚乙二醇（PEG）能极大地提高平末端连接的连接效率，PEG 4000的推荐添加量是连接体系的5%（w/v）；
5. 电转化效率可能通过对T4 DNA Ligase（Fast）热失活或者使用离心柱或 者氯仿抽提纯化DNA方式来提高；
6. 转化子数目可通过延长反应时间至1 h而增加。
| 象形图 | |
|---|---|
| 警示语 | |
| Class | |
| 警告声明 | |
| UNub | |
| 危险声明 | |
| Packing Group |
| MD001 T4 DNA Ligase（Fast）.pdf | 下载 |
扫码关注