中性蛋白酶（Neutral protease, NP）活性测定试剂盒说明书
微量法 100T/48S
正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定
测定意义：
NP在一定的温度和中性pH条件下，催化水解蛋白质。由于其安全无毒、水解能力强、作用范围广等特点，中性蛋白酶常用于食品、饲料、化妆品和营养保健品生产。
测定原理：
中性条件下，NP催化酪蛋白水解产生酪氨酸；在碱性条件下，酪氨酸还原磷钼酸化合物生成钨蓝；在680nm有特征吸收峰。
组成：
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产品名称
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PI004-100T/48S
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Storage
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试剂一：液体
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100ml
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4℃
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试剂二：粉剂
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1瓶
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4℃
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试剂三：粉剂
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1瓶
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4℃避光
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试剂四：粉剂
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1瓶
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4℃
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试剂五：液体
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4ml
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4℃
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标准品：液体
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1ml
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4℃
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说明书
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一份
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试剂二：粉剂×1瓶，4℃保存。临用前加4ml蒸馏水溶解。
试剂三：粉剂×1瓶，4℃避光保存。临用前加入10ml试剂一，沸水浴中磁力搅拌溶解。（可在烧杯上盖一层保鲜膜，注意观察，避免水分全部蒸发，一般加热15-30分钟，该试剂为过饱和试剂，充分混匀后仍出现颗粒物不溶物不影响使用）。
试剂四：粉剂×1瓶， 4℃保存。临用前加20ml蒸馏水溶解。
标准品：液体1ml×1支，0.25μmol/ml标准酪氨酸溶液，4℃保存。
自备仪器和用品：
可见分光光度计/酶标仪、微量玻璃比色皿/96孔板、水浴锅、磁力搅拌器、可调式移液枪、1.5 ml EP管和蒸馏水。
粗酶液提取：
1、组织：按照组织质量（g）：试剂一体积(ml)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1ml试剂一）冰浴匀浆，8000g，4℃离心10min，取上清，即粗酶液。
2、血清或培养液：直接测定。
3、细菌、真菌：按照细胞数量（104个）：试剂一体积（ml）为500~1000：1的比例（建议500万细胞加入1ml试剂一），冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声3秒，间隔7秒，总时间3min）；然后8000g，4℃，离心10min，取上清置于冰上待测。
测定操作：
1. 分光光度计/酶标仪预热30min，调节波长到680 nm，蒸馏水调零。
2. 试剂二、试剂三和试剂四置于30℃水浴保温30min。
3. 对照管：取0.5 ml EP管，加入20μl粗酶液，40μl试剂二，混匀后置于30℃水浴保温10min；加入40μl试剂三，混匀后8000g，4℃离心10min；取40μl上清液，加入新的EP管，再加入200μl试剂四，40μl试剂五，混匀后置于30℃水浴保温20min，取200μl于微量玻璃比色皿/96孔板，于680nm测定光吸收，记为A对照管。
4. 测定管：取0.5 ml EP管，加入20μl粗酶液，40μl试剂三，混匀后置于30℃水浴保温10min；加入40μl试剂二，混匀后8000g， 4℃离心10min；取40μl上清液，加入新的EP管，再加入200μl试剂四，40μl试剂五，混匀后置于30℃水浴保温20min，取200μl于微量玻璃比色皿/96孔板，于680nm测定光吸收，记为A测定管。（注意与空白管不同，先加试剂三，后加试剂二）
5. 空白管：取0.5 ml EP管，加入40μl蒸馏水，200μl试剂四，40μl试剂五，混匀后置于30℃水浴保温20min，取200μl于微量玻璃比色皿/96孔板，于680nm测定光吸收，记为A空白管。
6. 标准管：取0.5 ml EP管，加入40μl标准品，200μl试剂四，40μl试剂五，混匀后置于30℃水浴保温20min，取200μl于微量玻璃比色皿/96孔板，于680nm测定光吸收，记为A标准管。
注意：空白管和标准管只需要测定一次。
计算公式：
1. 按照样本蛋白浓度计算
NP活性单位定义：30℃每毫克蛋白每分钟水解产生1nmol酪氨酸为1个酶活单位。
NP活性（nmol/min /mg prot）= C标准品×（A测定管－A对照管）÷（A标准管－A空白管）×V反总÷(Cpr×V1)÷T= 125×（A测定管－A对照管）÷（A标准管－A空白管）÷Cpr
2．按照样本质量计算
NP活性单位定义：30℃每克样品每分钟催化水解产生1 nmol酪氨酸为1个酶活单位。
NP活性（nmol/min /g鲜重）=C标准品×（A测定管－A对照管）÷（A标准管－A空白管）×V反总÷（W×V1÷V2）÷T= 125×（A测定管－A对照管）÷（A标准管－A空白管）÷W
3. 按照液体体积计算
NP活性单位定义：30℃每毫升样品每分钟催化水解产生1nmol酪氨酸为1个酶活单位。
NP活性（nmol/min/ml）=C标准品×（A测定管－A对照管）÷（A标准管－A空白管）×V反总÷V1÷T= 125×（A测定管－A对照管）÷（A标准管－A空白管）
按照细胞数量计算
NP活性单位定义：30℃每104个细胞每分钟催化水解产生1nmol酪氨酸为1个酶活单位。
NP活性（nmol/min /104 cell）=C标准品×（A测定管－A对照管）÷（A标准管－A空白管）×V反总÷（细胞数量×V1÷V2）÷T= 125×（A测定管－A对照管）÷（A标准管－A空白管）÷细胞数量
C标准品：0.25 μ mol/ml标准酪氨酸溶液；V反总：酶促反应总体积，0.1ml；Cpr：粗酶液蛋白质浓度（mg/ml）；V1：加入反应体系中粗酶液体积（ml），0.02 ml；V2：提取液总体积（ml），1ml；T：催化反应时间（min），10min；W：样品质量（g）。
注意事项：
临用前配制的试剂配制好后4℃保存，并且3天内使用完毕。
