NADPH-细胞色素C还原酶（NCR）试剂盒说明书
分光光度法 50管/48样
正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定
测定意义：
细胞色素P450酶是一组主要存在于肝脏的同工酶，在外源物质代谢中具有重要作用，尤其是药物和毒物的代谢。NCR作为P450酶系的重要一员，催化氧化型P450还原再生。
测定原理：
NCR催化NADPH还原氧化型细胞色素c生成还原型细胞色素c，还原型细胞色素c在550nm处有特征吸收峰；通过测定550nm吸光度的增加速率，来计算NCR活性。
组成：
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产品名称
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CP001-50T/48S
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Storage
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试剂一：粉剂
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1瓶
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4℃
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试剂二：液体
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1瓶
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4℃
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试剂三：粉剂
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1瓶
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-20℃
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试剂四：粉剂
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1瓶
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4℃
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说明书
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一份
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试剂一：粉剂×1瓶，4℃保存。临用前加100ml蒸馏水充分溶解。
试剂三：粉剂×1瓶，-20℃保存。临用前配制，加2.6 ml蒸馏水充分溶解，4℃保存。
试剂四：粉剂×1瓶，4℃保存。临用前配制，加550 μl蒸馏水充分溶解，4℃保存。
自备仪器和用品：
可见分光光度计、普通离心机，超速离心机、可调式移液枪、1ml玻璃比色皿和蒸馏水。
粗酶液提取：
1、除去细胞核和线粒体等：称约0.5g组织，加入4℃预冷的1 ml试剂一，冰上充分研磨，10 000g 4℃离心30min，取上清液，转移到超速离心管中。
2、粗制微粒体：4℃，100 000g，离心60min，弃上清液。
3、除血红蛋白等杂质：向步骤2的沉淀中加1 ml试剂一，盖紧后充分震荡溶解，100 000g离心30min，弃上清液。
4、最终微粒体：向步骤3的沉淀中加试剂二0.5 ml，盖紧后充分震荡溶解，4℃保存待测。
测定操作：
1. 分光光度计预热30 min，调节波长到550 nm，蒸馏水调零。
2. 试剂二在37℃水浴中预热30min。
3. 空白管：取1ml玻璃比色皿，依次加入50μl蒸馏水、900μl试剂二、50μl试剂三和10μl试剂四，迅速混匀后于550nm处测定2min内吸光值变化，第10 s和第130 s吸光值分别记为A1和A2，△A空白管=A2-A1。
4. 测定管：取1ml玻璃比色皿，依次加入50μl粗酶液、900μl试剂二、50μl试剂三和10μl试剂四，迅速混匀后于550nm处测定2min内吸光值变化，第10 s和第130 s吸光值分别记为A3和A4，△A测定管=A4-A3。
注意：空白管只需要做一次。
计算公式：
(1).按照蛋白浓度计算
活性单位定义：37℃中，每毫克蛋白每分钟催化产生1nmol还原型细胞色素C为1个酶活单位。
NCR酶活性 (nmol/min/mg prot)= (△A测定管-△A空白管)÷ε÷d×V反总÷（Cpr×V样）÷T
= 529×(△A测定管-△A空白管)÷Cpr
(2)按照样本质量计算
活性单位定义：37℃中，每克样品每分钟催化产生1nmol还原型细胞色素C为1个酶活单位。
NCR酶活性(nmol/min/g 鲜重)= (△A测定管-△A空白管)÷ε÷d×V反总÷（W×V样÷V样总）÷ T
= 265×(△A测定管-△A空白管)÷W
ε：还原型细胞色素C摩尔消光系数，19100L/mol/cm=0.0191L/μmol/cm；d：比色皿光径，1cm；V反总：反应体系总体积，1010μl=0.00101L；Cpr：上清液蛋白质浓度，mg/ml，需要另外测定；V样：加入反应体系中上清液体积，50μl=0.05ml；V样总：加入提取液体积，0.5ml；W：样本质量，g；T：反应时间，2min。
注意事项：
试剂三、试剂四临用前配制，配好未使用完的4℃可保存两天。
