果糖-6-磷酸激酶(6-phosphofructokinase,PFK)试剂盒说明书
分光光度法 50管/48样
正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定
测定意义:
PFK(EC 2.7.1.11)广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中,负责将果糖-6-磷酸和ATP转化为果糖-1,6二磷酸和ADP,是糖酵解过程的关键调节酶之一。
测定原理:
PFK催化果糖-6-磷酸和ATP生成果糖-1,6-二磷酸和ADP,丙酮酸激酶和乳酸脱氢酶进一步依次催化NADH氧化生成NAD+,在340nm下测定NADH下降速率,即可反映PFK活性。组成:
产品名称
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GC007-50T/48S
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Storage
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提取液:液体
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60ml
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4℃
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试剂一:液体
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40ml
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4℃
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试剂二:粉剂
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1瓶
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-20℃
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试剂三:粉剂
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1支
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4℃
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试剂四:液体
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16μl
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4℃
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说明书
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一份
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试剂二:粉剂×1瓶,-20℃保存,临用前加入2.8ml蒸馏水充分溶解备用;用不完的试剂分装后-20度保存,禁止反复冻融;
试剂三:粉剂×1支,4℃保存,临用前加入260μl蒸馏水充分溶解备用;用不完的试剂分装后-20度保存,禁止反复冻融;
试剂四:液体16μl×1支,4℃保存,临用前加入260μl蒸馏水充分溶解备用;用不完的试剂分装后-20度保存,禁止反复冻融;
自备仪器和用品:
紫外分光光度计、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、1 ml石英比色皿、研钵、冰和蒸馏水。
样本的前处理:
1、细菌或培养细胞:先收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;按照细菌或细胞数量(104个):提取液体积(ml)为1000~5000:1的比例(建议2000万细菌或细胞加入1ml提取液),超声波破碎细菌或细胞(冰浴,功率20%或200W,超声3s,间隔10s,重复30次);8000g 4℃离心10min,取上清,置冰上待测。
2、组织:按照组织质量(g):提取液体积(ml)为1:5~10的比例(建议称取约0.1g组织,加入1ml提取液),进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心10min,取上清,置冰上待测。
3、血清(浆)样品:直接检测。
测定步骤和加样表:
1、 分光光度计预热30min以上,调节波长至340nm,蒸馏水调零。
2、工作液(可测25个样)的配制:取19ml试剂一和1.26ml试剂二充分混匀;用不完的试剂分装后-20度保存,禁止反复冻融;
3、将工作液置于37℃(哺乳动物)或25℃(其它物种)预热10分钟。
4、加样表:
试剂名称(μl)
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测定管
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工作液
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800
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样本
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30
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试剂三
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5
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试剂四
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5
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将上述试剂按顺序加入1 ml石英比色皿中,立即混匀,加试剂四的同时开始计时,记录在340 nm波长下20秒时的初始吸光度A1和10分20秒时的吸光度A2,计算ΔA=A1-A2。
注意:不同匀浆组织中PFK活力不一样,做正式试验之前请做1-2只预试,若ΔA>0.5,则说明活力太高,必须用提取液稀释成适当浓度匀浆上清液(计算公式中乘以相应稀释倍数),或缩短反应时间至2min或5min,使ΔA<0.5,以提高检测灵敏度。
PFK活力单位的计算:
1、血清(浆)PFK活力的计算:
单位的定义:每毫升血清(浆)每分钟催化1nmol果糖-6-磷酸和1nmolATP转化为1nmol果糖-1,6-二磷酸和1nmol ADP定义为一个酶活力单位。
PFK(nmol/min/ml)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷V样÷T=450×ΔA
2、组织、细菌或细胞中PFK活力计算:
(1)按样本蛋白浓度计算:
单位的定义:每mg组织蛋白每分钟催化1nmol果糖-6-磷酸和1nmolATP转化为1nmol果糖-1,6-二磷酸和1nmol ADP定义为一个酶活力单位。
PFK(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(V样×Cpr) ÷T=450×ΔA÷Cpr
(2)按样本鲜重计算
单位的定义:每g组织每分钟催化1nmol果糖-6-磷酸和1nmolATP转化为1nmol果糖-1,6-二磷酸和1nmol ADP定义为一个酶活力单位。
PFK(nmol/min/g 鲜重)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(W ×V样÷V样总)÷T=450×ΔA÷W
(3)按细菌或细胞密度计算
单位的定义:每1万个细菌或细胞每分钟催化1nmol果糖-6-磷酸和1nmolATP转化为1nmol果糖-1,6-二磷酸和1nmol ADP定义为一个酶活力单位。
PFK(nmol/min/104 cell)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(2000×V样÷V样总)÷T=0.225×ΔA
V反总:反应体系总体积,8.4×10-4 L;ε:NADH摩尔消光系数,6.22×103 L / mol /cm;d:比色皿光径,1cm;V样:加入样本体积,0.03 ml;V样总:加入提取液体积,1 ml;T:反应时间,10 min;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/ml;W:样本质量,g;2000:细菌或细胞总数,2000万。