Taq SYBR® Green qPCR Premix (None/Low/High ROX & Universal)
REF: MP008/MP009/MP010/MP023
储运条件
长期保存请于 -20℃避光保存，Mix 融解后可在4℃避光条件下稳定存放一个月，尽量避免反复冻融。
产品组成
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组分/规格
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MP008M |
MP009M |
MP010M |
MP023M |
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Taq SYBR® Green qPCR Premix (None ROX) |
5×1ml |
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Taq SYBR® Green qPCR Premix (Low ROX) |
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5×1ml |
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Taq SYBR® Green qPCR Premix (High ROX) |
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5×1ml |
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Taq SYBR® Green qPCR Premix (Universal) |
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5×1ml |
产品简介
Taq SYBR® Green qPCR Premix是SYBR® Green I嵌合染料法专用qPCR试剂，为2×预混液，包含除引物和DNA样品以外的所有qPCR组分，可减少操作步骤，缩短加样时间，降低污染几率。其核心组分是经抗体修饰的热启动Taq DNA聚合酶，配合精心优化的Buffer体系以及PCR反应促进因子，是产品具有特异性强、扩增效率高等特点，有效抑制非特异性扩增，可对宽广浓度范围的模板进行准确定量，获得稳定可靠的qPCR结果。
使用方法
1. 适用机型
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产品 |
适用机型 |
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MP008 (None ROX) |
Bio-Rad CFX 全系列； Roche LightCycler™ 系列； Eppendorf Mastercycler® ep realplex 系列； Qiagen/Corbett Rotor-Gene® 系列； Takara Thermal Cycler Dice； analytikjena qTOWER系列等 |
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MP009 (Low ROX) |
ABI 7500/7500 Fast，ABI ViiA 7™； ABI QuantStudio™ 系列； Stratagene Mx3000P®/3005P™/4000™ |
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MP010 (High ROX) |
ABI 7000/7300/7700/7900 HT/7900 HT Fast，StepOne™，StepOne Plus™等 |
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MP023（Universal） |
全机型通用 |
2. 使用注意
① 因 Mix 中预混有染料，其保存或反应体系配制过程应避免强光照射；
② 使用前上下颠倒轻轻混匀 Mix，请勿涡旋振荡混匀，避免产生过多气泡。
3. 建议的qPCR反应体系
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试剂 |
使用量 |
终浓度 |
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Taq SYBR® Green qPCR Premix |
10μl |
1× |
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正向引物 (10 μM)a |
0.4 μl |
0.2 μM |
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反向引物 (10 μM)a |
0.4 μl |
0.2 μM |
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DNA 模板 b |
X μl |
10~200ng/20 μl |
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Nuclease-Free Water |
To 20 μl |
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a.通常推荐的引物终浓度为0.2uM，反应效果不佳时可0.1~1μM范围内进行调整；
b.推荐模板加样量为1~2μl，如模板类型为未稀释cDNA原液，模板添加量不应超过总反应体系的10%。不同种类DNA模板中含有的靶基因拷贝数目不同，必要时可进行梯度稀释，以确定最佳的DNA模板添加量。
4. qPCR反应程序（可根据机型适当调整）
两步法
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步骤 |
温度 |
时间 |
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预变形 |
95 ℃ |
30 sec |
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变形 |
95 ℃ |
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退火&延伸a |
60℃ |
30 sec |
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熔解曲线b |
使用仪器默认采集程序 |
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三步法
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步骤 |
温度 |
时间 |
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预变形 |
95 ℃ |
30 sec |
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变形 |
95 ℃ |
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退火a |
55~65 ℃ |
10 sec 40 个循环 |
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延伸a |
72℃ |
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熔解曲线b |
使用仪器默认采集程序 |
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a.根据引物的Tm值进行退火（退火&延伸）温度的设定；若扩增片段在 200 bp以内，延伸（退火&延伸）时间可以设置为15 sec；此外，延伸时间的设置还需根据您使用的qPCR仪所需要的数据采集最短时间限制自行调整；
b. 不同qPCR仪的熔解曲线采集程序有差别，一般可使用仪器默认的熔解曲线采集程序。
5. 实验优化
若使用默认反应条件反应性能不佳时，则需要进行反应条件的优化，可以从引物浓度以及扩增程序两个方面进行：
①引物浓度调整
当引物终浓度在0.1～1.0μM范围之间变化时，引物浓度越低，扩增特异性越高，但扩增效率会有所下降。
②扩增程序优化
需提高扩增特异性，可使用两步法程序或提高退火温度；需提高扩增效率，可使用三步法程序或延长延伸时间。
6. 引物设计原则
① 扩增产物长度建议控制在 80～200 bp
② 引物长度为 18～25 bp；
③ 正向引物和反向引物的Tm 值相差不超过 1 ℃为佳，Tm 值控制在 58～62℃为佳；
④ 引物的 GC 含量控制在 40%～60% 之间；
⑤ 引物 A、G、C、T 整体分布尽量要均匀，避开 T/C 或者 A/G的连续结构（特别是 3'端）；
⑥ 引物 3' 端最后一个碱基最好为 G 或者 C；
⑦ 避开引物内部或者两条引物之间的互补序列；
⑧ 使用 NCBI BLAST 功能检索确认引物的特异性
常见问题
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问题描述 |
可能原因 |
解决办法 |
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扩增曲线不光滑 |
荧光信号太弱，经系统校正后产生 |
确保 Mix 中预混的染料未降解；更换荧光信号收集更好的 qPCR 专用耗材 |
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扩增曲线断裂或下滑 |
模板浓度较高，基线的终点值大于 Cq 值 |
减小基线终点 (Cq 值 -4)， 重新分析数据 |
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个别孔扩增曲线突然骤降 |
反应管内留有气泡 |
确保 Mix 完全溶解，请勿涡旋振荡混匀；加样完成后轻弹离心去除气泡； 延长预变性时间至10 min，以去除气泡 |
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反应结束无扩增曲线出现 |
反应循环数偏少 |
设置循环数为40，但更多的循环数会增加过多的背景信号 |
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荧光信号采集步骤未设置或者设置错误 |
两步法扩增程序一般将信号采集设置在退火 & 延伸阶段，三步法扩增程序应 当将信号采集设置在 72℃延伸阶段 |
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引物可能降解 |
长期未用的引物，应先通过 PAGE 电泳检测完整性，以排除其降解的可能 |
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模板浓度过低 |
减少模板稀释倍数重复实验，样品浓度未知的情况下先从最高浓度做起 |
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模板降解 |
重新制备模板，重复实验 |
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Cq 值出现过晚 |
扩增效率低 |
提高引物浓度，尝试三步法扩增程序，或者重新设计引物 |
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模板浓度过低 |
减少模板稀释倍数重复实验，样品浓度未知的情况下先从最高浓度做起 |
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模板降解 |
重新制备模板，重复实验 |
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扩增产物过长 |
扩增产物长度控制在 80~200 bp |
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体系中存在 PCR 抑制剂 |
一般为模板带入，加大模板稀释倍数或重新制备纯度高的模板重复实验 |
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空白对照出现信号 |
反应体系污染 |
首先更换空白对照的水，如果还发生同样情况，继续更换引物、吸头、 PCR 管或启用新的 Mix；反应体系在超净工作台内配制，减少气溶胶污染 |
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出现引物二聚体等非特异性扩增 |
一般在分析35 循环以后空白对照出现扩增产物属正常情况，应配合熔解曲线分析；重新设计引物，调整引物浓度或优化 PCR 反应程序 |
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熔解曲线出现多峰 |
引物设计不佳 |
根据引物设计原则重新设计新引物 |
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引物浓度过高 |
适当降低引物浓度 |
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实验重复性差 |
加样误差大 |
使用精准的移液器、配合高品质吸头准确移液；高倍稀释模板，加入大体积模板减少加样误差；放大qPCR反应体积 |
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模板浓度过低 |
减少模板稀释倍数重复实验 |
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qPCR 仪不同位置的温度偏差 |
定期校准 qPCR 仪 |
| 象形图 | |
|---|---|
| 警示语 | |
| Class | |
| 警告声明 | |
| UNub | |
| 危险声明 | |
| Packing Group |
| MP008 MP009 MP010 MP023 Taq SYBR® Green qPCR Premix.pdf | 下载 |
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