4-香豆酸：辅酶A连接酶（ 4-coumarate:CoA ligase，4CL)试剂盒说明书
分光光度法 50管/24样
正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定
测定意义：
4CL是连接苯丙酸途径与木质素特异合成途径的关键酶，主要催化肉桂酸生成相应的肉桂酸辅酶A酯，是合成木质素与其他苯丙烷类化合物的代谢流向调控点。该酶主要存在于高等植物、酵母和菌类中，研究该酶可以探讨多种生物细胞发育过程中木质素沉积的代谢机理，为减少水果石细胞含量而提高其品质提供依据。
测定原理：
4CL催化4-香豆酸和CoA生成4-香豆酸CoA，在333nm下测4-香豆酸CoA生成速率，即可反映4CL活性。
试剂的组成和配制：
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产品名称
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OT007-50T/24S
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Storage
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提取液：液体
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60ml
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4℃
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试剂一：液体
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60ml
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4℃
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试剂二：粉剂
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2瓶
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-20℃
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说明书
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一份
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需自备的仪器和用品：
紫外分光光度计、台式离心机、可调式移液器、1ml石英比色皿、研钵、冰和蒸馏水。
粗酶液提取：
细菌或培养细胞：
先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（104个）：提取液体积（ml）为500~1000：1的比例（建议500万细菌或细胞加入1ml提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率20％或200W，超声3s，间隔10s，重复30次）；8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。
组织：
按照组织质量（g）：提取液体积(ml)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1ml提取液），进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。
测定步骤：
1、分光光度计40℃预热30min以上，调节波长至333nm，蒸馏水调零。
2、样本测定
（1）在试剂二中加入12.5ml试剂一充分溶解混匀，置于40℃水浴预热10min；现配现用（配好后24h内用完）；
（2） 测定管：在1ml石英比色皿中加入50μl样本和950μl试剂二，混匀，立即记录333nm处40℃反应30min后的吸光值A2。
对照管：在1ml石英比色皿中加入50μl样本和950μl试剂一，混匀，立即记录333nm处40℃反应30min后的吸光值A1，计算ΔA=A2-A1。
注意：每个测定管设一个对照管。
4CL活性计算：
（1）按样本蛋白浓度计算：
单位定义：每mg组织蛋白每分钟生成1 nmol4-香豆酸辅酶A定义为一个酶活力单位。
4CL（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷(V样×Cpr) ÷T=31.75×ΔA÷Cpr
（2）按样本鲜重计算：
单位定义：每g组织每分钟生成1 nmol 4-香豆酸辅酶A定义为一个酶活力单位。
4CL（nmol/min/g 鲜重）＝[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷(W ×V样÷V样总) ÷T=31.75×ΔA÷W
（3）按细菌或细胞密度计算：
单位定义：每1万个细菌或细胞每分钟生成1 nmol 4-香豆酸辅酶A定义为一个酶活力单位。
4CL（nmol/min/104 cell）＝[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷(500×V样÷V样总) ÷T=0.063×ΔA
V反总：反应体系总体积，1×10-3 L；ε：4-香豆酸辅酶A摩尔消光系数，2.1×104 L / mol /cm；d：比色皿光径，1cm；V样：加入样本体积，0.05 ml；V样总：加入提取液体积，1 ml；T：反应时间，30 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/ml；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500万。
