糖原合成酶(Glycogen synthase,GCS)试剂盒说明书
分光光度法 50管/48样
正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定
测定意义:
GCS(EC 2.4.1.11)催化UDPG和葡萄糖残基生成糖原和UTP,以α-1,4-糖苷键相连延长糖链,是肝和肌肉糖原合成酶的限速酶,是胰岛素作用的主要靶酶,对糖代谢的调节和血糖稳态的维持具有重要作用。
测定原理:
GCS催化UDPG和葡萄糖残基生成糖原和UDP,丙酮酸激酶和乳酸脱氢酶进一步依次催化NADH氧化生成NAD+,在340nm下测定NADH下降速率,即可反映GCS活性。
组成:
产品名称
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GCS001-50T/48S
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Storage
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提取液:液体
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60ml
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4℃
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试剂一:液体
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45ml
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4℃
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试剂二:液体
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5ml
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4℃
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试剂三:液体
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41μl
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4℃
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试剂四:粉剂
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1支
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-20℃
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试剂五:粉剂
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1瓶
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-20℃
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说明书
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一份
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自备仪器和用品:
紫外分光光度计、台式离心机、可调式移液器、1 ml石英比色皿、研钵、冰和蒸馏水。
样本的前处理:
按照组织质量(g):提取液体积(ml)为1:5~10的比例(建议称取约0.1g组织,加入1ml提取液),进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心10min,取上清,置冰上待测。
测定步骤:
1、 分光光度计预热30min以上,调节波长至340nm,蒸馏水调零。
2、 工作液的配制:临用前将试剂三和试剂四转移到试剂一中混合溶解待用;用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融。
3、试剂五的配制:临用前在试剂五瓶中加入2.5ml试剂二充分溶解待用;用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融。
4、将工作液和试剂五置于37℃预热5分钟。
5、在1ml石英比色皿中加入50μl样本、50μl试剂五和900μl工作液,立即混匀,记录340nm处初始吸光值A1和1min后的吸光值A2,计算ΔA=A1-A2。
注意:在该试剂盒中,若ΔA大于0.1,需将样本用提取液稀释适当倍数后测定,使ΔA小于0.1可提高检测灵敏度。计算公式中乘以相应稀释倍数。
GCS活性计算:
(1)按样本蛋白浓度计算
单位定义:每mg组织蛋白每分钟消耗1nmol NADH定义为一个酶活力单位。
GCS(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(V样×Cpr) ÷T=3215×ΔA÷Cpr
(2)按样本鲜重计算
单位定义:每g组织每分钟消耗1 nmol NADH定义为一个酶活力单位。
GCS(nmol/min/g 鲜重)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(W ×V样÷V样总)÷T=3215×ΔA÷W
V反总:反应体系总体积,1×10-3 L;ε:NADH摩尔消光系数,6.22×103 L / mol /cm;d:比色皿光径,1cm;V样:加入样本体积,0.05 ml;V样总:加入提取液体积,1 ml;T:反应时间,1 min;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/ml;W:样本质量,g。