糖原磷酸化酶b(Glycogen phosphorylase b,GPb)试剂盒说明书
微量法 100管/48样
正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定
测定意义:
糖原磷酸化酶(Glycogen phosphorylase,GP,EC 2.4.1.1))是糖原分解代谢的关键酶,使糖原分子从非还原端逐个断开α-1,4-糖苷键移去葡萄糖基,释放1-磷酸葡萄糖,直至临近糖原分子α-1,6-糖苷键分支点前4个葡萄糖基处。GP分为有活性的糖原磷酸化酶a(GPa)和无活性的糖原磷酸化酶b(GPb)两种形式。GPb在一定浓度的腺苷酸(5,-AMP)存在下可被激活。
测定原理:
GP催化糖原和无机磷产生葡萄糖残基生成糖原和1-磷酸葡萄糖,磷酸葡萄糖变位酶和6-磷酸葡萄糖脱氢酶进一步依次催化NADP还原生成NADPH,在340nm下测定NADPH上升速率,即可反映GP活性。添加一定浓度的腺苷酸(5,-AMP)时测定GP(GPa和GPb)活性,未添加腺苷酸(5,-AMP)时测定GPa活性,GP活性-GPa活性得到GPb活性。
组成:
产品名称
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GCS006-100T/48S
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Storage
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提取液:液体
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100ml
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4℃
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试剂一:液体
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16ml
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4℃
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试剂二:粉剂
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1瓶
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-20℃
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试剂三:粉剂
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1支
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-20℃
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试剂四:粉剂
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1支
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-20℃
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试剂五:粉剂
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1支
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-20℃
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说明书
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一份
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自备仪器和用品:
紫外分光光度计/酶标仪、台式离心机、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研钵、冰和蒸馏水。
样本的前处理:
按照组织质量(g):提取液体积(ml)为1:5~10的比例(建议称取约0.1g组织,加入1ml提取液),进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心10min,取上清,置冰上待测。
测定步骤:
1、 分光光度计或酶标仪预热30min以上,调节波长至340nm,蒸馏水调零;
2、 工作液的配制:临用前将试剂二转移到试剂一中混合溶解待用;用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融。
3、 试剂三的配制:临用前在试剂三瓶中加入1ml蒸馏水充分溶解待用;用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融。
4、 试剂四的配制:临用前在试剂四瓶中加入1ml蒸馏水充分溶解待用;用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融。
5、 试剂五的配制:临用前在试剂五管中加入500μl蒸馏水充分溶解待用;用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融。
6、 将工作液、试剂三、试剂四和试剂五置于37℃预热5分钟;
7、 在微量石英比色皿或96孔板中加入10μl样本、10μl试剂三、10μl试剂四、10μl蒸馏水和160μl工作液,立即混匀,记录340nm处5min后的A1和10min后的吸光值A2,计算ΔAGPa=A2-A1。
8、 在微量石英比色皿或96孔板中加入10μl样本、10μl试剂三、10μl试剂四、10μl试剂五和160μl工作液,立即混匀,记录340nm处5min后的A3和10min后的吸光值A4,计算ΔAGP=A4-A3。
注意:由于每个样本需要同时测一个GP(GPa和GPb)活性和一个GPa活性,因此本试剂盒100管测48个样本。
GPb活性计算:
a.用微量石英比色皿测定的计算公式如下:
(1)按样本蛋白浓度计算
单位定义:每mg组织蛋白每分钟产生1nmol NADPH定义为一个酶活力单位。
GPb(nmol/min/mg prot)=[(ΔAGP-ΔAGPa)×V反总÷(ε×d)×109]÷(V样×Cpr) ÷T=643×(ΔAGP-ΔAGPa)÷Cpr
(2)按样本鲜重计算
单位定义:每g组织每分钟产生1nmol NADPH定义为一个酶活力单位。
GPb(nmol/min/g 鲜重)=[(ΔAGP-ΔAGPa)×V反总÷(ε×d)×109]÷(W ×V样÷V样总)÷T=643×(ΔAGP-ΔAGPa)÷W
V反总:反应体系总体积,2×10-4 L;ε:NADPH摩尔消光系数,6.22×103 L / mol /cm;d:比色皿光径,1cm;V样:加入样本体积,0.01 ml;V样总:加入提取液体积,1 ml;T:反应时间,5 min;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/ml;W:样本质量,g。
b.用96孔板测定的计算公式如下:
(1)按样本蛋白浓度计算
单位定义:每mg组织蛋白每分钟产生1nmol NADPH定义为一个酶活力单位。
GPb(nmol/min/mg prot)=[(ΔAGP-ΔAGPa)×V反总÷(ε×d)×109]÷(V样×Cpr) ÷T=1286×(ΔAGP-ΔAGPa)÷Cpr
(2)按样本鲜重计算
单位定义:每g组织每分钟产生1nmol NADPH定义为一个酶活力单位。
GPb(nmol/min/g 鲜重)=[(ΔAGP-ΔAGPa)×V反总÷(ε×d)×109]÷(W ×V样÷V样总)÷T=1286×(ΔAGP-ΔAGPa)÷W
V反总:反应体系总体积,2×10-4 L;ε:NADPH摩尔消光系数,6.22×103 L / mol /cm;d:96孔板光径,0.5cm;V样:加入样本体积,0.01 ml;V样总:加入提取液体积,1 ml;T:反应时间,5 min;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/ml;W:样本质量,g。