维生素B1（Vitamin B1，VB1）试剂盒说明书
微量法100T/96S
正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定
测定意义：
维生素B1（Vitamin B1）是构成脱羧辅酶的主要成分，参与细胞代谢中的三羧酸循环，是维持机体正常代谢必须的水溶性维生素，在生物体能量代谢中有重要的作用。
测定原理：
VB1在碱性条件下还原铁氰化钾生成亚铁氰化钾，亚铁氰化钾与Fe3+在弱酸条件下生成普鲁士蓝，在704nm有特征吸收峰。
组成：
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产品名称
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VS002-100T/96S
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Storage
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提取液：液体
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70ml
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4℃
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试剂一：液体
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1ml
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4℃
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试剂二：液体
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2ml
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4℃
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试剂三：液体
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2ml
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4℃避光
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试剂四：液体
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5ml
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4℃
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试剂五：液体
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3ml
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4℃避光
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说明书
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一份
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自备仪器和用品：
天平、研钵、离心机、可见分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔板、恒温水浴锅、蒸馏水。
样本处理：
1. 组织：将样品磨碎，按照质量（g）：提取液体积(ml)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g，加入0.6ml提取液）加入提取液，60℃浸提30min，加蒸馏水0.4ml，混匀后于25℃，16000rpm离心10min，取上清测定（动物组织等蛋白含量较高的样本建议离心20-30min）。
2. 细胞：按照细胞数量（104个）：提取液体积（ml）为500~1000：1的比例（建议500万细胞加入0.6ml提取液），冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声3秒，间隔7秒，总时间3min）；加蒸馏水0.4ml，混匀后于25℃，16000rpm离心10min，取上清测定。
3. 血清：直接测定。
测定操作：
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空白管
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测定管
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样品（μl）
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20
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试剂一（μl）
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20
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试剂二（μl）
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16
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16
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试剂三（μl）
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20
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20
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充分混匀，80℃反应10min
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提取液（μl）
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16
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16
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试剂四（μl）
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44
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44
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试剂五（μl）
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24
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24
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H2O（μl）
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60
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60
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充分混匀，静置20min，于微量石英比色皿/96孔板，蒸馏水调零，测定704nm处吸光值，记为A空白管和A测定管，△A=A测定管-A空白管。
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计算公式：
a. 用微量石英比色皿测定的计算公式如下
标准曲线：y = 0.017x+0.0031，R2 = 0.9991；x为标准品浓度：μg/ml；y为△A（A测定管-A空白管）
1. 按照蛋白含量计算
VB1含量（μg/mg prot）=（△A-0.0031）÷ 0.017÷Cpr
= 58.8×（△A-0.0031）÷ Cpr
2. 按照样本质量计算
VB1含量（μg/g鲜重）=（△A-0.0031）÷ 0.017÷（W÷V样总）
= 58.8×（△A-0.0031）÷ W
3. 按照细胞数量计算
VB1含量（μg/104 cell）=（△A-0.0031）÷ 0.017÷（细胞数量÷V样总）
= 58.8×（△A-0.0031）÷ 细胞数量
4. 按照液体体积计算
VB1含量（μg/ml）=（△A-0.0031）÷ 0.017
= 58.8×（△A-0.0031）
V样总：加入提取液体积，1ml；Cpr：蛋白浓度，mg/ml；W：样本质量，g
b．用96孔板测定的计算公式如下
标准曲线：y = 0.0085x +0.0031，R2 = 0.9991；x为标准品浓度：μg/ml；y为△A（A测定管-A空白管）
1. 按照蛋白含量计算
VB1含量（μg/mg prot）=（△A -0.0031）÷ 0.0085÷Cpr
= 117.65×（△A-0.0031）÷ Cpr
2. 按照样本质量计算
VB1含量（μg/g鲜重）=（△A-0.0031））÷ 0.0085÷（W÷V样总）
= 117.65×（△A-0.0031）÷ W
3. 按照细胞数量计算
VB1含量（μg/104 cell）=（△A-0.0031）÷ 0.0085÷（细胞数量÷V样总）
= 117.65×（△A-0.0031）÷ 细胞数量
4. 按照液体体积计算
VB1含量（μg/ml）=（△A-0.0031）÷ 0.0085
= 117.65×（△A-0.0031）
V样总：加入提取液体积，1ml；Cpr：蛋白浓度，mg/ml；W：样本质量，g
注意事项：
1. 若测定结果中吸光值超过2，请将样本稀释后进行测定，并在计算公式中乘以稀释倍数。
2. 蛋白浓度较高的样品，比如动物组织，若显色完成后有沉淀产生，将样本稀释后再重新测定，并在计算公式中乘以稀释倍数。
3. 显色完成后立即进行测定。
4. 标准曲线线性范围为0.1-10μg/ml。
