NAD-苹果酸酶（Malic enzyme，NAD-ME）试剂盒说明书
微量法 100管/96样
正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定
测定意义：
ME广泛存在于微生物、培养细胞、动物和植物胞浆中，尤其在植物组织中活性较高。ME催化苹果酸氧化脱羧的可逆反应，产生丙酮酸和CO2，以及伴随NAD(P)+的还原反应，是苹果酸代谢的关键酶。ME活性与生物合成和抗氧化密切相关。近年来植物ME活性测定较多，已经成为抗氧化研究的热点。根据辅酶专一性和对底物特异性的不同，可将ME分为NAD-ME(EC1.1.1.38)和NADP-ME(EC1.1.1.40)。
测定原理：
NAD-ME催化NAD+还原成NADH，在340nm下测定NADH增加速率。
组成：
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产品名称
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AE008-100T/96S
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Storage
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提取液：
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100ml
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4℃
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试剂一：液体
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20ml
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4℃
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试剂二：液体
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10ml
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4℃
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试剂三：粉剂
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1瓶
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-20℃
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说明书
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一份
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自备仪器和用品：
紫外分光光度计、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、1 ml石英比色皿和蒸馏水。
样本的前处理：
1、细菌、细胞或组织样品的制备：
细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（104个）：提取液体积（ml）为500~1000：1的比例（建议500万细菌或细胞加入1ml提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率20％或200W，超声3s，间隔10s，重复30次）；8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。
组织：按照组织质量（g）：提取液体积(ml)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1ml提取液），进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。
2、血清（浆）样品：直接检测。
测定步骤：
1、 分光光度计或酶标仪预热30min以上，调节波长至340nm，蒸馏水调零。
2、 检测工作液的配制：用时在试剂三中加入15ml试剂一和1ml蒸馏水，充分混匀待用；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。
3、 测定前将检测工作液在37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）水浴10min以上。
4、在微量石英比色皿或96孔板中加入10μl样本、55μl试剂二和160μl工作液，混匀后立即记录340nm处初始吸光值A1和 1min后的吸光值A2，计算ΔA=A2-A1。
注意：如果ΔA＜0.005，可将反应时间延长到2分钟或5分钟。
NAD-ME活性计算：
a.用微量石英比色皿测定的计算公式如下
（1）按样本蛋白浓度计算：
单位的定义：每mg组织蛋白每分钟生成1 nmol NADH定义为一个酶活力单位。
NAD-ME（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷(V样×Cpr) ÷T= 3617×ΔA÷Cpr
此法需要自行测定样本蛋白质浓度。
（2）按样本鲜重计算：
单位的定义：每g组织每分钟生成1 nmol NADH定义为一个酶活力单位。
NAD-ME（nmol/min/g 鲜重）＝[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷(W× V样÷V样总) ÷T = 3617×ΔA÷W
（3）按细菌或细胞密度计算：
单位的定义：每1万个细菌或细胞每分钟生成1 nmol NADH定义为一个酶活力单位。
NAD-ME（nmol/min/104 cell）=[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷(500×V样÷V样总) ÷T =7.234×ΔA
V反总：反应体系总体积，2.25×10-4 L；ε：NADH摩尔消光系数，6.22×103 L / mol /cm；d：比色皿光径，1cm；V样：加入样本体积，0.01 ml；V样总：加入提取液体积，1 ml；T：反应时间，1 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/ml；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500万。
b.用96孔板测定的计算公式如下
（1）按样本蛋白浓度计算：
单位的定义：每mg组织蛋白每分钟生成1 nmol NADH定义为一个酶活力单位。
NAD-ME（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷(Cpr×V样) ÷T= 7234×ΔA÷Cpr
此法需要自行测定样本蛋白质浓度。
（2）按样本鲜重计算：
单位的定义：每g组织每分钟生成1 nmol NADH定义为一个酶活力单位。
NAD-ME（nmol/min/g 鲜重）＝[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷(V样÷V样总×W) ÷T = 7234×ΔA÷W
（3）按细菌或细胞密度计算：
单位的定义：每1万个细菌或细胞每分钟生成1 nmol NADH定义为一个酶活力单位。
NAD-ME（nmol/min/104 cell）=[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷(V样÷V样总×500) ÷T =14.468×ΔA
V反总：反应体系总体积，2.25×10-4 L；ε：NADH摩尔消光系数，6.22×103 L / mol；d：96孔板光径，0.5cm；V样：加入样本体积，0.01 ml；V样总：加入提取液体积，1 ml；T：反应时间，1 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/ml；W：样本质量；500：细菌或细胞总数，500万。
