NADP磷酸酶（NADPase）试剂盒说明书
微量法 100管/96样
正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定
测定意义：
NADPase主要存在于植物组织中，是生物体内唯一催化NADP+降解为NAD+的酶，与NADK一起调控NAD和NADP之间的平衡。
测定原理：
NADPase能够催化NADP+水解为NAD+和无机磷的反应，通过测定无机磷的量来测定NADPase活性。
组成：
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产品名称
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AE012-100T/96S
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Storage
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提取液：
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100ml
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4℃
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试剂一：液体
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15ml
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4℃
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试剂二：粉剂
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1瓶×4
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-20℃
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试剂三：粉剂
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1瓶
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4℃
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试剂四：粉剂
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1瓶
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4℃
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试剂五：液体
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25ml
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RT
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试剂六：10mmol/L 标准磷贮备液
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10ml
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4℃
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说明书
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一份
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试剂二：粉剂×4支，-20℃保存；用时加入1 ml试剂一充分溶解备用，现配现用。
试剂三：粉剂×1 瓶, 4℃保存。用时加入25ml蒸馏水，溶解后4℃可保存一周。
试剂四：粉剂×1瓶, 4℃保存。用时加入25ml蒸馏水，溶解后4℃可保存一周。
试剂六：10mmol/L 标准磷贮备液 10ml×1 瓶，4℃保存。
0.5μmol/ml 标准磷应用液配制：将试剂六20倍稀释，即取 0.5ml试剂六加9.5蒸馏水，充分混匀。
定磷试剂的配制：按H2O: 试剂三:试剂四:试剂五=2:1:1:1 的比例配制，配好的定磷试剂应为浅黄色，若无色则试剂失效，若是蓝色则为磷污染，定磷剂现用现配。
注意：配试剂最好用新的烧杯、玻棒和玻璃移液器，也可以用一次性塑料器皿，避免磷污染。
自备仪器和用品：
可见分光光度计/酶标仪、恒温水浴锅、台式离心机、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研钵、冰和蒸馏水
样本的前处理：
按照组织质量（g）：提取液体积(ml)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1ml提取液），进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。
测定步骤：
1、分光光度计或酶标仪预热30min以上，调节波长至660nm，蒸馏水调零。
2、酶促反应（在EP管中加入下列试剂）
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试剂名称（μl）
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测定管
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对照管
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试剂一
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120
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120
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试剂二
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40
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40
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37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）预热5min
37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）准确反应30min后，95℃水浴5min（盖紧，以防止水分散失），冷却后，10000g 25℃离心5min，取上清
3、定磷（在EP管或96孔板中加入下列试剂）
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标准管
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空白管
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测定管
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对照管
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0.5μmol/ml标准磷应用液
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20
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蒸馏水
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20
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上清液
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20
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20
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定磷试剂
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200
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200
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200
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200
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混匀，25℃室温放置30min，在 660nm处，记录各管吸光值。
注意事项：
1、此法具有微量、灵敏、快速的特点。所以对测定所用试管要求严格，要没有一点磷，若试管放过磷酸或磷酸盐缓冲液，一定要洗得非常干净，要先用洗洁精加水煮，再用自来水冲，最后用蒸馏水冲干净。最好用一次性塑料管或新玻璃管，避免磷污染是检测成败的关键。
2、标准管、空白管和对照管只要做一次即可。
NADPase酶活性计算：
1、按组织蛋白浓度计算：
定义：每小时每毫克组织蛋白NADPase分解NADP 产生1μmol无机磷的量为一个 NADPase活力单位。
NADPase (μmol/h/mg prot)=(C标准管×V总)×(A测定管-A对照管)÷(A标准管-A空白管)÷
(V样×Cpr)÷T=5×(A测定管-A对照管)÷(A标准管-A空白管)÷Cpr
2、按样本鲜重计算：
定义：每小时每g组织NADPase分解NADP 产生1μmol无机磷的量为一个 NADPase活力单位。
NADPase (μmol/h /g鲜重)=(C标准管×V总)×(A测定管-A对照管)÷(A标准管-A空白管）×V总÷(W× V样÷V样总)÷T=5×(A测定管-A对照管)÷(A标准管-A空白管)÷W
C标准管：标准管浓度，0.5μmol/ml；V总：酶促反应总体积，0.2ml；V样：加入样本体积，0.04ml ；V样总：加入提取液体积，1ml；T：反应时间，0.5小时；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/ml；W：样本鲜重，g。
