α-半乳糖苷酶(α-Galactosidase, α-GAL)试剂盒说明书
分光光度法 50管/24样
正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定
测定意义:
α-GAL (EC 3.2.1.22)广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中,能专一地催化α半乳糖苷键的水解,主要参与棉子糖、水苏糖、蜜二糖和半乳甘露聚糖等半乳糖苷的降解。α-GAL对于植物种子的萌发至关重要,种子萌发初期,其催化产生的D-半乳糖通过糖酵解途径迅速转化和消耗,为种子的萌发提供最初的能量来源,后期则主要参与细胞壁储藏多糖水解。
测定原理:
α-GAL分解对-硝基苯-α-D-吡喃半乳糖苷生成对-硝基苯酚,后者在400nm有最大吸收峰,通过测定吸光值升高速率来计算α-GAL活性。
组成:
产品名称
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GMS030-50T/24S
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Storage
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提取液:液体
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50ml
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4℃
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试剂一:粉剂
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1瓶
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-20℃
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试剂二:液体
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15ml
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4℃
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试剂三:液体
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50ml
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4℃
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说明书
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一份
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试剂一:粉剂×1瓶,-20℃保存;临用前每瓶加入5ml蒸馏水,充分溶解备用;用不完的试剂仍-20℃保存。
自备仪器和用品:
可见分光光度计、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、1ml玻璃比色皿、研钵、冰和蒸馏水。
粗酶液提取:
1、细菌或培养细胞:先收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;按照细菌或细胞数量(104个):提取液体积(ml)为500~1000:1的比例(建议500万细菌或细胞加入1ml提取液),超声波破碎细菌或细胞(冰浴,功率20%或200W,超声3s,间隔10s,重复30次);15000g 4℃离心10min,取上清,置冰上待测。
2、组织:按照组织质量(g):提取液体积(ml)为1:5~10的比例(建议称取约0.1g组织,加入1ml提取液),进行冰浴匀浆。15000g 4℃离心10min,取上清,置冰上待测。
测定步骤:
1、 分光光度计预热30min以上,调节波长至400nm,蒸馏水调零。
2、样本测定(在EP管中依次加入下列试剂):
试剂名称(μl)
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测定管
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对照管
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试剂一
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200
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蒸馏水
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200
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试剂二
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250
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250
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样本
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50
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50
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迅速混匀,放入37℃准确水浴30min
充分混匀,400nm处测定吸光值A,计算ΔA=A测定-A对照。每个测定管需设一个对照管。
α-GAL活性计算:
标准条件下测定的回归方程为y =0.00543x -0.0027;x为标准品浓度(nmol/ml),y为吸光值。
(1)按样本蛋白浓度计算:
单位的定义:每mg组织蛋白每分钟产生1nmol对-硝基苯酚定义为一个酶活力单位。
α-GAL活力(nmol/min/mg prot)=[(ΔA+0.0027)÷0.00543×V反总]÷(V样×Cpr)÷T
=61.39×(ΔA+0.0027) ÷Cpr
需要另外测定,建议使用本公司BCA蛋白质含量测定试剂盒。
(2)按样本鲜重计算:
单位的定义:每g组织每分钟产生1nmol对-硝基苯酚定义为一个酶活力单位。
α-GAL活力(nmol/min /g鲜重)=[(ΔA+0.0027)÷0.00543×V反总]÷(W×V样÷V样总)÷T
=61.39×(ΔA+0.0027) ÷W
(3)按细菌或细胞密度计算:
单位的定义:每1万个细菌或细胞每分钟产生1nmol对-硝基苯酚定义为一个酶活力单位。
α-GAL活力(nmol/min /104 cell)=[(ΔA+0.0027) ÷0.00543×V反总]÷(500×V样÷V样总)÷T
=0.123×(ΔA +0.0027)
V反总:反应体系总体积,0.5ml;V样:加入反应体系中样本体积,0.05ml;V样总:加入提取液体积,1ml;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/ml;W:样本质量,g; 500:细胞或细菌总数,500万;T:反应时间,30min。