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α-半乳糖苷酶(α-GAL)检测试剂盒(微量法100T/48S)
GMS031
α-Galactosidase (α-GAL) Activity Assay Kit (Microassay)
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GMS031-100T/48S 100T/48S ¥1180.00

 

α-半乳糖苷酶α-Galactosidase, α-GAL)试剂盒说明书

                                                       微量法 100/48

正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定                                             

测定意义:

α-GAL (EC 3.2.1.22)广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中,能专一地催化α半乳糖苷键的水解,主要参与棉子糖、水苏糖、蜜二糖和半乳甘露聚糖等半乳糖苷的降解。α-GAL对于植物种子的萌发至关重要,种子萌发初期,其催化产生的D-半乳糖通过糖酵解途径迅速转化和消耗,为种子的萌发提供最初的能量来源,后期则主要参与细胞壁储藏多糖水解。

测定原理:

α-GAL分解对-硝基苯-α-D-吡喃半乳糖苷生成对-硝基苯酚,后者在400nm有最大吸收峰,通过测定吸光值升高速率来计算α-GAL活性。

组成:

产品名称

GMS031-100T/48S

Storage

提取液:液体

100ml

4℃

试剂一:粉剂

1

-20℃

试剂二:液体

4ml

4℃

试剂三:液体

13ml

4℃

说明书

一份

自备仪器和用品:

可见分光光度计/酶标仪、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研钵、冰和蒸馏水。

试剂一:粉剂×1瓶,-20℃保存;临用前加入2.5ml蒸馏水,充分溶解备用;用不完的试剂仍-20℃保存。

粗酶液提取:

1、细菌或培养细胞:先收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;按照细菌或细胞数量(104个):提取液体积(ml)为500~10001的比例(建议500万细菌或细胞加入1ml提取液),超声波破碎细菌或细胞(冰浴,功率20%或200W,超声3s,间隔10s,重复30次);15000g 4℃离心10min,取上清,置冰上待测。

2、组织:按照组织质量(g):提取液体积(ml)15~10的比例(建议称取约0.1g组织,加入1ml提取液),进行冰浴匀浆。15000g 4℃离心10min,取上清,置冰上待测。

测定步骤:

1、 分光光度计或酶标仪预热30min以上,调节波长至400nm,蒸馏水调零。

2、样本测定(在EP管或96孔板中依次加入下列试剂):

试剂名称(μl

测定管

对照管

试剂一

25

 

蒸馏水

 

25

试剂二

35

35

样本

10

10

迅速混匀,放入37℃保温30min

试剂三

130

130

充分混匀, 400nm处测定吸光值A,计算ΔA=A测定-A对照。每个测定管需设一个对照管。

α-GAL活性计算:

a.用微量石英比色皿测定的计算公式如下

标准条件下测定的回归方程为y = 0.00585x -0.0027x为标准品浓度(nmol/ml),y为吸光值。

1)按样本蛋白浓度计算:

单位的定义:每mg组织蛋白每分钟产生1nmol-硝基苯酚定义为一个酶活性单位。

α-GAL活性(nmol/min/mg prot)=[(ΔA+0.0027) ÷0.00585×V反总]÷(V×Cpr)÷T

=39.89×(ΔA+0.0027) ÷Cpr

2)按样本鲜重计算:

单位的定义:每g组织每分钟产生1nmol-硝基苯酚定义为一个酶活性单位。

α-GAL活性(nmol/min/g鲜重)=[(ΔA+0.0027)÷0.00585×V反总(W×V÷V样总)÷T

=39.89×(ΔA+0.0027) ÷W

3)按细菌或细胞密度计算:

单位的定义:每1万个细菌或细胞每分钟产生1nmol-硝基苯酚定义为一个酶活性单位。

α-GAL活性(nmol/min/104cell) =[(ΔA+0.0027) ÷0.00585×V反总(500×V÷V样总)÷T

=0.08×(ΔA +0.0027)

V反总:反应体系总体积,0.07mlV样:加入反应体系中样本体积,0.01mlV样总:加入提取液体积,1mlCpr:样本蛋白质浓度,mg/mlW:样本质量,g500:细胞或细菌总数,500万;T:反应时间,30min

b.96孔板测定的计算公式如下

标准条件下测定的回归方程为y = 0.0039x -0.0027x为标准品浓度(nmol/ml),y为吸光值。

1)按样本蛋白浓度计算:

单位的定义:每mg组织蛋白每分钟产生1nmol-硝基苯酚定义为一个酶活性单位。

α-GAL活性(nmol/min/mg prot)=[(ΔA+0.0027) ÷0.0039×V反总]÷(V×Cpr)÷T

=59.83×(ΔA+0.0027) ÷Cpr

2)按样本鲜重计算:

单位的定义:每g组织每分钟产生1nmol-硝基苯酚定义为一个酶活性单位。

α-GAL活性(nmol/min/g鲜重)=[(ΔA+0.0027)÷0.0039×V反总(W×V÷V样总)÷T

=59.83×(ΔA+0.0027) ÷W

3)按细菌或细胞密度计算:

单位的定义:每1万个细菌或细胞每分钟产生1nmol-硝基苯酚定义为一个酶活性单位。

α-GAL活性(nmol/min/104cell) =[(ΔA+0.0027) ÷0.0039×V反总(500×V÷V样总)÷T

 =0.12×(ΔA +0.0027)

V反总:反应体系总体积,0.07mlV样:加入反应体系中样本体积,0.01mlV样总:加入提取液体积,1mlCpr:样本蛋白质浓度,mg/mlW:样本质量,g500:细胞或细菌总数,500万;T:反应时间,30min

 

 

 

象形图
警示语
Class
警告声明
UNub
危险声明
Packing Group
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