γ-谷氨酰半胱氨酸连接酶（GCL）说明书
微量法 100T/96S
正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定
测定意义：
GCL 是 GSH 合成的限速酶，GSH 对 GCL 有反馈抑制作用。GCL基因表达受多种因素调节，如氧化剂、抗氧化剂、生长因子和炎症因子等。GCL活性高低对GSH含量和GSH/GSSG比值有重要影响。
测定原理：
在ATP和Mg2+存在下，GCL催化谷氨酸和半胱氨酸合成γ-谷氨酰半胱氨酸；同时ATP去磷酸化产生无机磷分子，通过测定无机磷增加速率，即可计算出GCL活性。
组成：
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产品名称
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GSH016-100T/96S
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Storage
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试剂一：液体
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105ml
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4℃
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试剂二：粉剂
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1瓶
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4℃
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试剂三：粉剂
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1管
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4℃
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试剂四：液体
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7ml
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室温
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试剂五：粉剂
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1瓶
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4℃
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说明书
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一份
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试剂二：粉剂×1瓶，4℃保存。临用前加6 ml蒸馏水充分震荡溶解。
试剂三：粉剂×1管，4℃保存。临用前加入蒸馏水1.5 ml充分震荡溶解。
试剂五：粉剂×1瓶，4℃保存。临用前加入12 ml蒸馏水，充分震荡溶解后，缓缓加入400µl浓硫酸（自备），边加边搅拌。
自备仪器和用品：
冷冻离心机、水浴锅、移液器、可见分光光度计/酶标仪、微量玻璃比色皿/96孔板、浓硫酸和蒸馏水。
粗酶液提取：
1. 组织：按照组织质量（g）：试剂一体积(ml)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1ml试剂一）进行冰浴匀浆。8000g，4℃离心10min，取上清，置冰上待测。
2. 细菌、真菌：按照细胞数量（104个）：试剂一体积（ml）为500~1000：1的比例（建议500万细胞加入1ml试剂一），冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声3秒，间隔7秒，总时间3min）；然后8000g，4℃，离心10min，取上清置于冰上待测。
3. 血清等液体：直接测定。
GCL测定操作：
1. 分光光度计/酶标仪预热30min，调节波长到660nm，蒸馏水调零。
2. 空白管：取1.5mlEp管，依次加入试剂一48µl、试剂二52µl、试剂三12µl和蒸馏水24µl，混匀后盖紧，37℃水浴准确反应15 min；再加入试剂四60µl，混匀后，室温（25℃左右）8000g，离心10 min，取上清100µl，加入试剂五100µl，混匀后盖紧，45℃水浴10min，冷却后测定660nm处光吸收，记为A空白管。
3. 测定管：取1.5mlEp管，依次加入试剂一48µl、试剂二52µl、试剂三12µl和上清液24µl，混匀后盖紧，37℃水浴准确反应15 min；再加入试剂四60µl，混匀后，室温（25℃左右）8000g，离心10 min，取上清100µl，加入试剂五100µl，混匀后盖紧，45℃水浴10min，冷却后测定660nm处光吸收，记为A测定管。
注意：空白管只需要测定一次。
GCL活性计算公式：
标准曲线：y=0.1427x，R2=0.9987
a. 使用微量石英比色皿测定的计算公式如下
(1). 按蛋白浓度计算
活性单位定义：37℃下，每毫克蛋白每分钟催化产生1μg无机磷的GCL酶活量为1个酶活单位。
GCL（μg/min /mg prot）=[（A测定管-A空白管）÷0.1427×V反总]÷(Cpr×V样)÷T
=3.815×（A测定管-A空白管）÷Cpr
（2）按样本质量计算
活性单位定义：37℃下，每克组织每分钟催化产生1μg无机磷的GCL酶活量为为1个酶活单位。
GCL（μg/min /g 鲜重）= [（A测定管-A空白管）÷0.1427×V反总]÷(W×V样÷V样总)÷T
= 3.815×（A测定管-A空白管）÷W
（3）按细胞数量计算
活性单位定义：37℃下，每104个细胞每分钟催化产生1μg无机磷的GCL酶活量为1个酶活单位。
GCL（μg/min /104 cell）=[（A测定管-A空白管）÷ 0.1427×V反总]÷(细胞数量×V样÷V样总)÷T
= 3.815×（A测定管-A空白管）÷细胞数量
（4）按照液体体积计算
活性单位定义：37℃下，每毫升液体每分钟催化产生1μg无机磷的GCL酶活量为1个酶活单位。
GCL（μg/min /ml）= [（A测定管-A空白管）÷ 0.1427×V反总]÷V样÷T
= 3.815×（A测定管-A空白管）
0.1427：回归方程系数；V反总：反应总体积（ml）196 µl=0.196 ml；Cpr：上清液蛋白质浓度，mg/ml； V样：加入反应体系中上清液体积，24µl =2.4×10-2 ml；V样总：提取液体积，1 ml；W：样本质量，g；T：反应时间：15min。
b. 使用96孔板测定的计算公式如下
标准曲线：y=0.07135x，R2=0.9987
（(1). 按蛋白浓度计算
活性单位定义：37℃下，每毫克蛋白每分钟催化产生1μg无机磷的GCL酶活量为1个酶活单位。
GCL（μg/min /mg prot）= [（A测定管-A空白管）÷0.07135×V反总]÷(Cpr×V样)÷T
=7.63×（A测定管-A空白管）÷Cpr
（2）按样本质量计算
活性单位定义：37℃下，每克组织每分钟催化产生1μg无机磷的GCL酶活量为为1个酶活单位。
GCL（μg/min /g 鲜重）= [（A测定管-A空白管）÷0.07135×V反总]÷(W×V样÷V样总)÷T
= 7.63×（A测定管-A空白管）÷W
（3）按细胞数量计算
活性单位定义：37℃下，每104个细胞每分钟催化产生1μg无机磷的GCL酶活量为1个酶活单位。
GCL（μg/min /104 cell）=[（A测定管-A空白管）÷0.07135×V反总]÷(细胞数量×V样÷V样总)÷T
= 7.63×（A测定管-A空白管）÷细胞数量
（4）按照液体体积计算
活性单位定义：37℃下，每毫升液体每分钟催化产生1μg无机磷的GCL酶活量为1个酶活单位。
GCL（μg/min /ml）= [（A测定管-A空白管）÷0.07135×V反总]÷V样÷T
=7.63×（A测定管-A空白管）
0.07135：回归方程系数；V反总：反应总体积（ml）196 µl=0.196 ml；Cpr：上清液蛋白质浓度，mg/ml； V样：加入反应体系中上清液体积，24µl =2.4×10-2 ml；V样总：提取液体积，1 ml；T：反应时间：15min。
注意事项：
1、样品处理等过程均需要在冰上进行，且须在当日测定酶活力，以免影响其活力。如果是匀浆液，避免反复冻融。
2、所有试剂配制完后，除表明4℃保存外，请于1天内用完。
3、实验过程请带手套，试剂三中有强腐蚀性物质，注意不要溅到皮肤上或眼睛内。
4、测定吸光值时请于水浴后10～40分钟内测完。
5、样本测定前先取1-2个样做预实验，如吸光值太高，应先用试剂一(或者生理盐水)稀释到适当倍数，使得吸光值在标准曲线范围内，哺乳动物组织和血液一般稀释3～5倍。
6、试剂三配制过程中，可能会产生黑色固体，其不影响结果，注意吸取时不要将黑色固体吸入。
7、细胞中GCL活性测定时，细胞数目须在300万-500万之间，细胞中GCL的提取时可加试剂一（或生理盐水）后研磨或超声波处理，不能用细胞裂解液处理细胞；
