亮氨酸氨基肽酶（Leucine Aminopeptidase, LAP）试剂盒说明书
微量法 100管/96样
正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定 测定意义：
LAP是一类能水解肽链N-末端为亮氨酸的酶，广泛存在于肝、肾、胰等组织中，尤其以肝脏中含量最为丰富。各类肝病患者因肝细胞损伤，血清LAP的活性均有不同程度的升高，因此，血清LAP活性的检测能从不同侧面反映各种肝病的发生和发展。
测定原理：
LAP分解L-亮氨酰对硝基苯胺生成对硝基苯胺，后者在405nm有最大吸收峰，通过测定吸光值升高速率来计算LAP活性。
组成：
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产品名称
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AC010-100T/96S
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Storage
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提取液：液体
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100ml
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4℃
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试剂一：液体
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15ml
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4℃
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试剂二：粉剂
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1瓶
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-20℃
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说明书
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1份
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自备仪器和用品：
酶标仪/可见分光光度计、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、96孔板/微量石英比色皿、研钵、冰和蒸馏水。
样品的前处理：
1、细菌、细胞或组织样品的制备：
细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（104个）：提取液体积（ml）为1000~5000：1的比例（建议2000万细菌或细胞加入1ml提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率20％或200W，超声3s，间隔10s，重复30次）；8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。
组织：按照组织质量（g）：提取液体积(ml)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1ml提取液），进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。
2、血清（浆）样品：直接检测。
LAP测定步骤：
1、分光光度计或酶标仪预热30min以上，调节波长至405nm，蒸馏水调零。
2、将试剂二转移至试剂一中充分溶解（如较难溶解，可50℃水浴加热约30min促进溶解）；在37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）水浴10min以上；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。
3、在微量石英比色皿或96孔板中加入50μl样本和150μl试剂一，混匀后立即记录405nm处初始吸光值A1和 2min后的吸光值A2，计算ΔA=A2-A1。
注意事项：若ΔA大于0.5，需将酶液用提取液稀释，计算公式中乘以相应稀释倍数。使A2-A1小于0.5，可提高检测灵敏度。
LAP活力单位的计算：
a.用微量石英比色皿测定的计算公式如下
1、血清（浆）LAP活力的计算:
单位的定义：每ml血清（浆）每分钟生成1 nmol的对硝基苯胺定义为一个酶活力单位。
LAP（nmol/min/ml）＝[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷V样÷T=205.8×ΔA
2、组织、细菌或细胞中LAP活力的计算:
（1）按样本蛋白浓度计算：
单位的定义：每mg组织蛋白每分钟生成1 nmol 对硝基苯胺定义为一个酶活力单位。
LAP（nmol/min /mg prot）＝[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷(V样×Cpr) ÷T=205.8×ΔA÷Cpr
（2）按样本鲜重计算：
单位的定义：每g组织每分钟生成1 nmol 对硝基苯胺定义为一个酶活力单位。
LAP（nmol/min /g 鲜重）＝[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷(W× V样÷V样总) ÷T=205.8×ΔA÷W
（3）按细菌或细胞密度计算：
单位的定义：每1万个细菌或细胞每分钟生成1 nmol 对硝基苯胺定义为一个酶活力单位。
LAP（nmol/min /104 cell）＝[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷(2000×V样÷V样总) ÷T=0.103×ΔA
V反总：反应体系总体积，2×10-4 L；ε：对硝基苯胺摩尔消光系数，9.72×103 L / mol /cm；d：比色皿光径，1cm；V样：加入样本体积，0.05 ml；V样总：加入提取液体积，1 ml；T：反应时间，2 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/ml；W：样本质量，g；2000：细菌或细胞总数，2000万。
b.用96孔板测定的计算公式如下
1、血清（浆）LAP活力的计算:
单位的定义：每ml血清（浆）每分钟生成1 nmol的对硝基苯胺定义为一个酶活力单位。
LAP（nmol/min /ml）＝[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷V样÷T=411.5×ΔA
2、组织、细菌或细胞中LAP活力的计算:
（1）按样本蛋白浓度计算：
单位的定义：每mg组织蛋白每分钟生成1 nmol 对硝基苯胺定义为一个酶活力单位。
LAP（nmol/min /mg prot）＝[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷ (V样×Cpr) ÷T=411.5×ΔA÷Cpr
（2）按样本鲜重计算：
单位的定义：每g组织每分钟生成1 nmol 对硝基苯胺定义为一个酶活力单位。
LAP（nmol/min /g 鲜重）＝[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷(W× V样÷V样总) ÷T=411.5×ΔA÷W
（3）按细菌或细胞密度计算：
单位的定义：每1万个细菌或细胞每分钟生成1 nmol 对硝基苯胺定义为一个酶活力单位。
LAP（nmol/min /104 cell）＝[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷(2000×V样÷V样总) ÷T=0.206×ΔA
V反总：反应体系总体积，2×10-4 L；ε：对硝基苯胺摩尔消光系数，9.72×103 L / mol /cm；d：96孔板光径，0.5cm；V样：加入样本体积，0.05 ml；V样总：加入提取液体积，1 ml；T：反应时间，2min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/ml；W：样本质量，g；2000：细菌或细胞总数，2000万。
GOT（nmol/min/mg prot）=[（ΔA+0.0013）÷0.2384×V1]÷(V1×Cpr)÷T×103 =209.7×（ΔA+0.0013）÷Cpr
需要另外测定，建议使用本公司BCA蛋白质含量测定试剂盒。
（2） 按样本鲜重计算：
单位的定义：每g组织每分钟催化产生1nmol丙酮酸定义为一个酶活力单位。
GOT（nmol/min/g鲜重）=[（ΔA+0.0013）÷0.2384×V1]÷(W×V1÷V2)÷T×103 =209.7×（ΔA+0.0013）÷W
（3）按细菌或细胞密度计算：
单位的定义：每1万个细菌或细胞每分钟催化产生1nmol丙酮酸定义为一个酶活力单位。
GOT（nmol/min/104 cell）= [（ΔA+0.0013）÷0.2384×V1]÷(500×V1÷V2)÷T×103 =0.419×（ΔA+0.0013）
V1：加入反应体系中样本体积，0.01ml；V2：加入提取液体积，1 ml；T：反应时间，20 min；Cpr：蛋白质浓度，mg/ml；W：样本质量，g；500：细胞或细菌总数，500万；103：1umol/ml=103 nmol/ml。
1、标准曲线线性范围为：0.01 umol/ml -2 umol/ml。
2、ΔA线性范围为：0.01 -1。
