NADP-苹果酸脱氢酶（NADP-MDH）试剂盒说明书
分光光度法 50管/48样
正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定
测定意义：
MDH （EC 1.1.1.37）广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，线粒体中MDH是TCA循环的关键酶之一，催化苹果酸形成草酰乙酸；相反，胞浆中MDH催化草酰乙酸形成苹果酸。草酰乙酸是重要的中间产物， 连接多条重要的代谢途径。因此，MDH在细胞多种生理活动中扮演着重要的角色，包括线粒体的能量代谢、 苹果酸-天冬氨酸穿梭系统、活性氧代谢和抗病性等。根据不同的辅酶特异性，MDH分为NAD-依赖的MDH和NADP-依赖的MDH， NADP-MDH主要存在于真核细胞中。
测定原理：
NADP-MDH催化NADPH还原草酰乙酸生成苹果酸，导致340nm处光吸收下降。
组成：
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产品名称
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CE008-50T/48S
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Storage
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试剂一：提取液
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60 ml
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4℃
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试剂二：液体
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50 ml
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4℃
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试剂三：粉剂
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2支
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-20℃
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试剂四：粉剂
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2支
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-20℃
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说明书
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一份
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试剂三、粉剂×2支，-20℃保存；临用前加入300μl蒸馏水；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。
试剂四、粉剂×2支，-20℃保存；临用前加入300μl蒸馏水；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。
自备仪器和用品：
紫外分光光度计、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、1 ml石英比色皿和蒸馏水。
样本测定的准备：
1、细菌、细胞或组织样品的制备：
细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（104个）：试剂一体积（ml）为500~1000：1的比例（建议500万细菌或细胞加入1ml试剂一），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率20％或200W，超声3s，间隔10s，重复30次）；8000g 4℃离心10min，取上清置冰上待测。
组织：按照组织质量（g）：试剂一体积(ml)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1ml试剂一），进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。
2、血清（浆）样品：直接检测。
测定步骤：
1、 分光光度计预热30min以上，调节波长至340nm，蒸馏水调零。
2、 将试剂二在37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）水浴10min以上。
3、 操作表：
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试剂名称（μl）
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测定孔
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样本
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20
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试剂二
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760
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试剂三
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10
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试剂四
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10
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将上述试剂按顺序加入1 ml石英比色皿中，混匀后立即在340 nm波长下记录初始吸光度A1和反应1min后的吸光度A2，计算ΔA=A1-A2。
注意：若A1-A2大于0.5，需将样本用提取液稀释，使A1-A2小于0.5，可提高检测灵敏度。计算公式中乘以相应稀释倍数。
NADP-MDH活力单位的计算：
1、血清（浆）NADP-MDH活力的计算
单位的定义：每毫升血清（浆）每分钟消耗1 nmol的NADPH定义为一个酶活力单位。
NADP-MDH（nmol/min/ml）=[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷V样÷T=6430×ΔA
2、组织、细菌或细胞中NADP-MDH活力的计算:
（1）按样本蛋白浓度计算：
单位的定义：每mg组织蛋白每分钟消耗1 nmol的NADPH定义为一个酶活力单位。
NADP-MDH（nmol/min/mg prot）=[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷(V样×Cpr) ÷T=6430×ΔA÷Cpr
（2）按样本鲜重计算：
单位的定义：每g组织每分钟消耗1 nmol的NADPH定义为一个酶活力单位。
NADP-MDH（nmol/min/g 鲜重）=[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷（W ×V样÷V样总）÷T =6430×ΔA÷W
（3）按细菌或细胞密度计算：
单位的定义：每1万个细菌或细胞每分钟消耗1 nmol的NADPH定义为一个酶活力单位。
NADP-MDH（nmol/min/104 cell）=[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷（V样÷V样总×500）÷T=12.86×ΔA
V反总：反应体系总体积，8×10-4 L；ε：NADPH摩尔消光系数，6.22×103 L / mol /cm；d：比色皿光径，1cm；V样：加入样本体积，0.02 ml；V样总：加入提取液体积，1 ml；T：反应时间，1 min；W：样本质量，g；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/ml；500：细胞或细菌总数，500万。
