柠檬酸合酶（citrate synthase，CS）试剂盒说明书
微量法 100管/48样
正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定
测定意义：
CS（EC 2.3.3.1）广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞的线粒体基质中，是三羧酸循环第一个限速酶，是三羧酸循环主要调控位点之一。
测定原理：
CS催化乙酰CoA和草酰乙酸产生柠檬酰辅酶A，进一步水解产生柠檬酸；该反应促使无色的DTNB转变成黄色的TNB，在 412nm处有特征吸光值。
组成：
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产品名称
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CE010-100T/48S
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Storage
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试剂一：液体
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100ml
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-20℃
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试剂二：液体
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20ml
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-20℃
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试剂三：液体
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1.5ml
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-20℃
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试剂四：液体
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28ml
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4℃
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试剂五：粉剂
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1瓶
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4℃
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试剂六：粉剂
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1支
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-20℃
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说明书
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一份
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试剂六：粉剂×1支，-20℃保存，临用前加入1.2ml蒸馏水，用不完的试剂仍-20℃保存；
自备仪器和用品：
可见分光光度计/酶标仪、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研钵、冰、无水乙醇和蒸馏水
样本的前处理：
组织、细菌或细胞中胞浆蛋白与线粒体蛋白的分离：
① 称取约0.1g组织或收集500万细胞，加入1ml试剂一和10μl 试剂三，用冰浴匀浆器或研钵匀浆。
② 将匀浆600g，4℃离心5min。
③ 弃沉淀，将上清液移至另一离心管中，11000g，4℃离心10min。
④ 上清液即胞浆提取物，可用于测定从线粒体泄漏的CS（此步可选做）。
⑤ 在步骤④的沉淀中加入200μl试剂二和2μl 试剂三，超声波破碎（冰浴，功率20％或200W，超声3秒，间隔10秒，重复30次），用于线粒体CS测定。
测定步骤：
1、分光光度计或酶标仪预热30min以上，调节波长至412nm，蒸馏水调零。
2、样本测定
（1）在试剂五中加入0.6ml无水乙醇和13ml试剂四，混匀，37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）孵育5min；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融；
（2）测定管：在微量石英比色皿或96孔板中加入10μl样本、220μl试剂五和10μl试剂六，混匀，37℃反应15min后立即测定吸光值A1。
（3）对照管：在微量石英比色皿或96孔板中加入10μl样本、220μl试剂四和10μl试剂六，混匀，37℃反应15min后立即测定吸光值A2。
（4）计算ΔA=A1-A2，每个测定管设一个对照管。
CS活性计算：
a. 使用微量石英比色皿测定的计算公式如下：
（1）按样本蛋白浓度计算：
单位的定义：每mg组织蛋白每分钟催化产生1 nmol TNB定义为一个酶活力单位。
CS（nmol/min /mg prot）＝[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷(V样×Cpr) ÷T=117.6×ΔA÷Cpr
此法需要自行测定样本蛋白质浓度。
（2）按样本鲜重计算：
单位的定义：每g组织每分钟催化产生1 nmol TNB定义为一个酶活力单位。
CS（nmol/min /g 鲜重）=[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷（W× V样÷V样总）÷T=23.8×ΔA÷W
（3）按细菌或细胞密度计算：
单位的定义：每1万个细菌或细胞每分钟催化产生1 nmol TNB定义为一个酶活力单位。
CS（nmol/min /104 cell）=[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷（500×V样÷V样总）÷T=0.0475×ΔA
V反总：反应体系总体积，2.4×10-4 L；ε：TNB摩尔消光系数，1.36×104 L / mol /cm；d：比色皿光径，1cm；V样：加入样本体积，0.01 ml；V样总：加入提取液体积，0.202 ml；T：反应时间，15 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/ml；W：样本质量，g；500：细胞或细菌总数，500万。
b. 使用96孔板测定的计算公式如下：
（1）按样本蛋白浓度计算：
单位的定义：每mg组织蛋白每分钟催化产生1 nmol TNB定义为一个酶活力单位。
CS（nmol/min /mg prot）＝[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷(V样×Cpr) ÷T=235.3×ΔA÷Cpr
此法需要自行测定样本蛋白质浓度。
（2）按样本鲜重计算：
单位的定义：每g组织每分钟催化产生1 nmol TNB定义为一个酶活力单位。
CS（nmol/min /g 鲜重）=[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷（W ×V样÷V样总）÷T=47.5×ΔA÷W
（3）按细菌或细胞密度计算：
单位的定义：每1万个细菌或细胞每分钟催化产生1 nmol TNB定义为一个酶活力单位。
CS（nmol/min /104 cell）=[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷（500×V样÷V样总）÷T=0.095×ΔA
V反总：反应体系总体积，2.4×10-4 L；ε：TNB摩尔消光系数，1.36×104 L / mol /cm；d：96孔板光径，0.5cm；V样：加入样本体积，0.01 ml；V样总：加入提取液体积，0.202 ml；T：反应时间，15 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/ml；W：样本质量，g；500：细胞或细菌总数，500万。
