乙醇含量测定试剂盒说明书
微量法 100管/96样
正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定
测定意义：
乙醇俗称酒精，是最常见的一元醇，在检测酒的质量、分析血液乙醇含量和果蔬品质判断中通常需要频繁、大量地检测乙醇含量。
1.乙醇是酒的主要成分，是衡量酒质量的重要指标之一。我国是世界上最早发明酿酒的国家，也是酒类产品消费大国，其消费量居世界之首。因此，快速、准确测定酒中乙醇含量，对于确保酒的质量和保护消费者的健康具有重大意义。
2.乙醇是中枢神经系统最基本的抑制物，如果乙醇被大量摄入，会不可逆抑制呼吸甚至导致死亡，血液中乙醇检测结果通常作为认定是否酒后驾驶或醉酒驾驶的依据。
3.乙醇是判断储藏过程中果蔬品质变化的重要指标，研究表明，适当的乙醇处理能够减少腐烂和减轻果蔬生理病害、延缓果蔬成熟和衰老进程，从而延长货架寿命。因此，简便、准确和快速测定果蔬中乙醇含量具有非常重要的意义。
测定原理：
乙醇在乙醇脱氢酶的催化下氧化脱氢生成乙醛，同时，NAD被还原生成NADH，NADH在1-mPMS的作用下使WST-8显橙黄色，通过450 nm下测定吸光值变化可测得乙醇含量。
组成：
|
产品名称
|
CE021-100T/96S
|
Storage
|
|
试剂一：液体
|
12ml
|
4℃
|
|
试剂二：粉剂
|
1瓶
|
-20℃
|
|
试剂三：液体
|
10 ml
|
4℃
|
|
试剂四：液体
|
1.5ml
|
4℃避光
|
|
说明书
|
一份
|
试剂二：粉剂×1瓶, -20℃保存；临用前加入6 ml试剂三充分溶解待用，用不完的试剂分装后-20℃保存；
自备仪器和用品：
酶标仪、台式离心机、可调式移液器、96孔板、研钵、冰、蒸馏水。
乙醇提取：
1. 组织：按照组织质量（g）：蒸馏水体积(ml)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1ml蒸馏水），进行匀浆，8000g，25℃离心10min，取上清待测。
2. 细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（104个）：蒸馏水体积（ml）为500~1000：1的比例（建议500万细菌或细胞加入1ml蒸馏水），超声波破碎（冰浴，功率20％或200W，超声3s，间隔10s，重复30次）， 8000g，25℃离心10min，取上清待测。
3. 血清（浆）等液体样品：直接测定。
测定步骤：
1. 酶标仪预热30min以上，调节波长至450nm。
2. 工作液的配制：临用前按照样本数量，按以下比例配制工作液
|
试剂名称
|
体积（μl）
|
|
试剂一
|
100
|
|
试剂二
|
50
|
|
试剂四
|
10
|
3. 样本测定
按下表在96孔板中加入如下试剂
|
试剂名称
|
体积（μl）
|
|
样本
|
40
|
|
测定工作液
|
160
|
混匀后记录450nm下测定初始吸光值A1，和37℃避光孵育10min后的吸光值A2，计算
△A=A2-A1。
乙醇含量计算：
标准条件下测定回归方程为y = 0.0256x + 0.0055 R2 = 0.9991；
x为乙醇含量（μmol/ml），y为吸光值差值△A。
1. 按照血清（浆）体积计算
乙醇含量（μmol/ml）= (△A-0.0055)÷0.0256
=39.1×(△A-0.0055)
2. 按照样品质量计算
乙醇含量（μmol/g鲜重）= [ (△A-0.0055)÷0.0256×V1]÷(W ×V1÷V2）
= 39.1×(△A-0.0055)÷W
3. 按照细菌或细胞密度计算
乙醇含量（μmol/104 cell）= [ (△A-0.0055)÷0.0256×V1]÷（500×V1÷V2）
=0.078×(△A-0.0055)
V1：加入反应体系中样本体积，0.04ml；V2：加入提取液体积，1 ml； Cpr：样本蛋白质浓度，mg/ml；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500万；
注意事项：
测定前取1-2个样做预实验，若△A﹥0.3或乙醇含量﹥10μmol/ml，需将样本用蒸馏水稀释后再测定，以确保测定的准确性。
最低检测限：0.02μmol/ml。
