Ca++ Mg++- ATP酶活性测定说明书
分光光度法 50管/24样
正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定
测定意义：
Ca++ Mg++-ATP酶广泛分布于植物、动物、微生物和细胞中，可催化ATP水解生成ADP和无机磷。
测定原理：
根据Ca++ Mg++-ATP酶分解ATP生成ADP及无机磷，通过测定无机磷的量来确定ATP酶活性高低。
试剂的组成和配制：
|
产品名称
|
OP001-50T/24S
|
Storage
|
|
提取液：液体
|
50ml
|
4℃
|
|
试剂一：液体
|
10ml
|
4℃
|
|
试剂二：液体
|
5ml
|
4℃
|
|
试剂三：液体
|
5ml
|
4℃
|
|
试剂四：粉剂
|
1支×3
|
-20℃
|
|
试剂五：液体
|
5ml
|
4℃
|
|
试剂六：粉剂
|
1瓶
|
4℃
|
|
试剂七：粉剂
|
1瓶
|
4℃
|
|
试剂八：粉剂
|
1瓶
|
4℃
|
|
试剂九：液体
|
25ml
|
室温
|
|
试剂十：10mmol/L标准磷贮备液
|
10ml
|
4℃
|
|
说明书
|
一份
|
试剂四：粉剂×3 支，-20℃保存。用时每支加1ml蒸馏水，现用现配；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融；
试剂六：粉剂×1瓶，4℃保存。用时加入3ml蒸馏水， 4℃保存；
试剂七：粉剂×1瓶, 4℃保存。用时加入25ml蒸馏水，溶解后4℃保存一周；
试剂八：粉剂×1瓶, 4℃保存。用时加入25ml蒸馏水，溶解后4℃保存一周；
0.5μmol/ml标准磷应用液配制：将试剂十 20倍稀释，即取 0.1ml试剂十加1.9ml蒸馏水充分混匀；
定磷剂的配制：按H2O: 试剂七:试剂八:试剂九=2:1:1:1 的比例配制，配好的定磷剂应为浅黄色。若无色则试剂失效，若是蓝色则为磷污染，定磷剂现用现配。
注意：配试剂最好用新的烧杯、玻棒和玻璃移液器，也可以用一次性塑料器皿，避免磷污染。
需自备的仪器及用品:
可见分光光度计、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、1ml玻璃比色皿、研钵、冰和蒸馏水。
样品酶液的制备：
1、细菌、细胞或组织样品的制备：
细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（104个）：提取液体积（ml）为500~1000：1的比例（建议500万细菌或细胞加入1ml提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率20％或200W，超声3s，间隔10s，重复30次）；8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。
组织：按照组织质量（g）：提取液体积(ml)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1ml提取液），进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。
2、血清（浆）样品：直接检测。
操作步骤：
1、 分光光度计预热30min以上，调节波长至660nm，蒸馏水调零；
2、 加样表(在1.5ml棕色EP管中按下表依次加样）；
|
试剂名称(μl)
|
对照管
|
测定管
|
|
试剂一（μl）
|
130
|
90
|
|
试剂二（μl）
|
40
|
40
|
|
试剂三（μl）
|
40
|
40
|
|
试剂四（μl）
|
40
|
40
|
|
试剂五（μl）
|
|
40
|
|
样本 （μl）
|
|
200
|
混匀，37℃（哺乳动物）或25℃（其他物种）准确水浴10min
|
试剂六（μl）
|
50
|
50
|
|
样本 （μl）
|
200
|
|
混匀，8000g，25℃离心10min，取上清液
3定磷（1.5mlEP管中依次加入下列试剂）
|
|
空白管
|
标准管
|
对照管
|
测定管
|
|
0.5μmol/ml标准磷应用液（μl）
|
|
100
|
|
|
|
上清液（μl）
|
|
|
100
|
100
|
|
蒸馏水（μl）
|
100
|
|
|
|
|
定磷试剂（μl）
|
1000
|
1000
|
1000
|
1000
|
混匀，室温放置30 min，在 660nm处比色。
注意事项：
1、由于每一个样都必须做对照，本试剂盒50管只能测 24份Ca++ Mg++-ATP酶。
2、此法具有微量、灵敏、快速的特点。所以对测定所用试管要求严格无磷。避免磷污染是检测成败的关键。
3、空白管和标准管只要做一管。
计算：
1、血清（浆）Ca++ Mg++- ATPase活力的计算:
定义：规定每小时每毫升血清（浆）中Ca++ Mg++- ATP 酶分解ATP 产生1μmol无机磷的量为一个酶活力单位。
Ca++ Mg++-ATP酶活力（μmol /h/ mL）=[ C标准管×V总]×（A测定管-A对照管）÷（A标准管-A空白管）÷V样÷T=7.5×（A测定管-A对照管）÷（A标准管-A空白管）
组织中Ca++ Mg++- ATPase的计算：
2、组织、细菌或细胞中Ca++ Mg++- ATPase活力的计算：
（1）按蛋白浓度计算：
定义：每小时每毫克组织蛋白中Ca++ Mg++- ATP 酶分解ATP 产生1μmol无机磷的量为一个酶活力单位。
Ca++ Mg++-ATP酶活力(μmol/h/mg)=[C标准管×V总]×（A测定管-A对照管）÷（A标准管-A空白管）÷（V样×Cpr）÷T =7.5×（A测定管-A对照管）÷（A标准管-A空白管）÷Cpr
（2）按样本鲜重计算：
定义：每小时每克组织中Ca++ Mg++-ATP 酶分解ATP 产生1μmol无机磷的量为一个酶活力单位。
Ca++ Mg++-ATP酶活力(μmol/h/g)= [C标准管×V总]×（A测定管-A对照管）÷（A标准管-A空白管）÷(W× V样÷V样总)÷T=7.5×（A测定管-A对照管）÷（A标准管-A空白管）÷W
（3）按细菌或细胞密度计算：
定义：规定每小时每1万个细菌或细胞中Ca++ Mg++-ATP 酶分解ATP 产生1μmol无机磷的量为一个酶活力单位。
Ca++ Mg++-ATP酶活力(μmol/h /104)= [C标准管×V总]×（A测定管-A对照管）÷（A标准管-A空白管）÷(500×V样÷V样总)÷T=0.015×（A测定管-A对照管）÷（A标准管-A空白管）
C标准管：标准管浓度，0.5μmol/mL；V总：酶促反应总体积，0.5mL；V样：加入样本体积，0.2mL ；V样总：加入提取液体积，1mL；T：反应时间，1/6小时；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本鲜重，g；500：细菌或细胞总数，500万。
