线粒体转氢酶-2(TH-2)试剂盒说明书
微量法 100管/96样
正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定
测定意义:
TH位于线粒体的内膜上,又称为线粒体复合体六,催化NADH+NADP+和NAD++NADPH相互转化,调节线粒体NAD(H)和NADP(H)平衡。把逆向反应称为TH-2,催化NADPH和NAD+生成NADP+和NADH。
测定原理:
NADH和NADPH均在340nm有特征吸收,因此TH催化的转氢反应不能导致340nm吸光度发生变化。用人工合成底物3-乙酰吡啶腺嘌呤二核苷酸(APAD+)替代NAD+,TH-2催化APAD+还原生成APADH,APADH在375nm有特征光吸收,测定375nm光吸收的增加速率,来计算TH-2活性。
试剂的组成和配制:
产品名称
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OP021-100T/96S
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Storage
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试剂一:液体
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100ml
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-20℃
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试剂二:液体
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50ml
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-20℃
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试剂三:液体
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18ml
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4℃
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试剂四:粉剂
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1支
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-20℃
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试剂五:粉剂
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1支
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-20℃
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说明书
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一份
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需自备的仪器和用品:
可见分光光度计、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、1mL玻璃比色皿、研钵、冰和蒸馏水。
样本的前处理:
组织、细菌或细胞中胞浆蛋白与线粒体蛋白的分离:
1、准确称取0.1g组织或收集500万细胞,加入1mL试剂一,用冰浴匀浆器或研钵匀浆。
2、将匀浆600g,4℃离心5min。
3、弃沉淀,将上清液移至另一离心管中,11000g,4℃离心10min。
4、上清液即为除去线粒体的胞浆蛋白,可用于测定从线粒体泄漏的TH-2(此步可选做)。
5、步骤4中的沉淀即为线粒体,加入500uL试剂二,超声波破碎(冰浴,功率20%或200W,超声3s,间隔10秒,重复30次),用于TH-2活性测定。
测定步骤:
1、分光光度计或酶标仪预热30min以上,调节波长至375nm,蒸馏水调零。
2、样本测定
(1)工作液的配制:临用前将试剂四、五转移到试剂三中混合溶解,置于37℃(哺乳动物)或25℃(其它物种)水浴5min;用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融。
(2)在微量石英比色皿或96孔板中加入20μL样本和180μL工作液,混匀,立即记录375nm处初始吸光值A1和 10min后的吸光值A2,计算ΔA=A2-A1。
TH-2活性计算:
a. 用微量石英比色皿测定的计算公式如
(1) 按样本蛋白浓度计算
单位的定义:每mg组织蛋白每分钟产生1 nmol APADH定义为一个酶活性单位。
TH-2活性(nmol/min /mg prot)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(V样×Cpr)÷T=149×ΔA÷Cpr
(2) 按样本鲜重计算
单位的定义:每g组织每分钟产生1 nmol APADH定义为一个酶活性单位。
TH-2活性(nmol/min /g 鲜重)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(W× V样÷V样总) ÷T=74.5×ΔA÷W
(3) 按细菌或细胞密度计算
单位的定义:每1万个细菌或细胞每分钟产生1 nmol APADH定义为一个酶活性单位。
TH-2活性(nmol/min /104 cell)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(500×V样÷V样总) ÷T=0.149×ΔA
V反总:反应体系总体积,2×10-4 L;ε:APADH摩尔消光系数,6.7×103 L / mol /cm;d:比色皿光径,1cm;V样:加入样本体积,0.02 mL;V样总:加入提取液体积,0.5mL;T:反应时间,10 min;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量,g;500:细菌或细胞总数,500万。
b.用96孔板测定的计算公式如下
(1) 按样本蛋白浓度计算
单位的定义:每mg组织蛋白每分钟产生1 nmol APADH定义为一个酶活性单位。
TH-2活性(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(V样×Cpr)÷T=298×ΔA÷Cpr
(2) 按样本鲜重计算
单位的定义:每g组织每分钟产生1 nmol APADH定义为一个酶活性单位。
TH-2活性(nmol/min/g 鲜重)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(W× V样÷V样总) ÷T=149×ΔA÷W
(3) 按细菌或细胞密度计算
单位的定义:每1万个细菌或细胞每分钟产生1 nmol APADH定义为一个酶活性单位。
TH-2活性(nmol/min/104 cell)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(500×V样÷V样总) ÷T=0.298×ΔA
V反总:反应体系总体积,2×10-4 L;ε:APADH摩尔消光系数,6.7×103 L / mol /cm;d:96孔板光径,0.5cm;V样:加入样本体积,0.02 mL;V样总:加入提取液体积,0.5mL;T:反应时间,10 min;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量,g;500:细菌或细胞总数,500万。