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转氢酶-2检测试剂盒(分光光度法50T/48S)
OP020
Mitochondrial Transhydrogenase-2 Activity Assay Kit (Spectrophotometry)
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OP020-50T/48S 50T/48S ¥380.00

线粒体转氢酶-2TH-2)试剂盒说明书

                                                  分光光度法 50/48

正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定                                             

测定意义:

TH位于线粒体的内膜上,又称为线粒体复合体六,催化NADH+NADP+NAD++NADPH相互转化,调节线粒体NAD(H)NADP(H)平衡。把逆向反应称为TH-2,催化NADPHNAD+生成NADP+NADH

测定原理:

NADHNADPH均在340nm有特征吸收,因此TH催化的转氢反应不能导致340nm吸光度发生变化。用人工合成底物3-乙酰吡啶腺嘌呤二核苷酸(APAD+)替代NAD+TH-2催化APAD+还原生成APADHAPADH375nm有特征光吸收,测定375nm光吸收的增加速率,来计算TH-2活性。

试剂的组成和配制:

产品名称

OP020-50T/48S

Storage

试剂一:液体

50ml

-20

试剂二:液体

25ml

-20

试剂三:液体

25ml×2

4

试剂:粉剂

2

-20

试剂五:粉剂

2

-20

说明书

一份

需自备的仪器和用品:

可见分光光度计、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、1mL玻璃比色皿、研钵、冰和蒸馏水。

样本的前处理:

组织、细菌或细胞中胞浆蛋白与线粒体蛋白的分离:

1、准确称取0.1g组织或收集500万细菌或细胞,加入1mL试剂一,用冰浴匀浆器或研钵匀浆。

2、将匀浆600g4℃离心5min

3、弃沉淀,将上清液移至另一离心管中,11100g4℃离心10min

4、上清液即为除去线粒体的胞浆蛋白,可用于测定从线粒体泄漏的TH-2(此步可选做)。

5、步骤4中的沉淀即为线粒体,加入500uL试剂二,超声波破碎(冰浴,功率20%或200W,超声3s,间隔10秒,重复30次),用于TH-2活性测定。

测定步骤:

1、 分光光度计预热30min以上,调节波长至375nm,蒸馏水调零。

2、 样本测定

1)工作液的配制:临用前取试剂三、试剂四和试剂五各一支,将试剂四、五转移到试剂三中混合溶解,置于37℃(哺乳动物)或25℃(其它物种)水浴5min;用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融。

2)在1mL玻璃比色皿中加入100μL样本和1000μL工作液,混匀,立即记录375nm处初始吸光值A110min后的吸光值A2,计算ΔA=A2-A1

TH-2活性计算

1) 按样本蛋白浓度计算

单位的定义:每mg组织蛋白每分钟产生1 nmol APADH定义为一个酶活性单位。

 TH-2活性(nmol/min /mg prot=[ΔA×V反总÷ε×d×109]÷(V×Cpr)÷T=164×ΔA÷Cpr

2) 按样本鲜重计算

单位的定义:每g组织每分钟产生1 nmol APADH定义为一个酶活性单位。

TH-2活性(nmol/min/g 鲜重)=[ΔA×V反总÷ε×d×109]÷(W× V÷V样总) ÷T=82×ΔA÷W

3) 按细菌或细胞密度计算

单位的定义:每1万个细菌或细胞每分钟产生1 nmol APADH定义为一个酶活性单位。

TH-2活性(nmol/min/104 cell=[ΔA×V反总÷ε×d×109]÷(500×V÷V样总) ÷T=0.164×ΔA

V反总:反应体系总体积,1.1×10-3LεAPADH摩尔消光系数,6.7×103 L / mol /cmd:比色皿光径,1cmV样:加入样本体积,0.1mLV样总:加入提取液体积,0.5mLT:反应时间,10 minCpr:样本蛋白质浓度,mg/mLW:样本质量,g500:细菌或细胞总数,500万。

象形图
警示语
Class
警告声明
UNub
危险声明
Packing Group
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