Na+K+- ATP酶活性测定说明书
微量法 100管/48样
正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定
测定意义：
Na+K+- ATP酶广泛分布于植物、动物、微生物和细胞中，可催化ATP水解生成ADP和无机磷。
测定原理：
Na+K+-ATP酶分解ATP生成ADP及无机磷，通过测定无机磷的量来确定ATP酶活性。
试剂的组成和配制：
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产品名称
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OP004-100T/48S
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Storage
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提取液：液体
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100ml
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4℃
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试剂一：液体
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10ml
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4℃
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试剂二：粉剂
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1瓶
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-20℃
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试剂三：液体
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2ml
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4℃
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试剂四：粉剂
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1瓶
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4℃
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试剂五：粉剂
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1瓶
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4℃
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试剂六：粉剂
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1瓶
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4℃
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试剂七：液体
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25ml
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室温
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试剂八：10mmol/L 标准磷贮备液
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10ml
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4℃
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说明书
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一份
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试剂二：粉剂×1瓶，-20℃保存；临用前加入6ml蒸馏水充分混匀待用；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融；
试剂四：粉剂×1瓶，4℃保存。用时加入3mL蒸馏水， 4℃保存。
试剂五：粉剂×1瓶, 4℃保存。用时加入25ml蒸馏水，溶解后4℃保存一周；
试剂六：粉剂×1瓶, 4℃保存。用时加入25ml蒸馏水，溶解后4℃保存一周；
0.5μmol/ml 标准磷应用液配制：将试剂八 20倍稀释，即取 0.1ml试剂八加1.9ml蒸馏水充分混匀；
定磷剂的配制：按H2O: 试剂五:试剂六:试剂七=2:1:1:1 的比例配制，配好的定磷剂应为浅黄色。若无色则试剂失效，若是蓝色则为磷污染，定磷剂现用现配。
注意：配试剂最好用新的烧杯、玻棒和玻璃移液器，也可以用一次性塑料器皿，避免磷污染。
需自备的仪器和用品:
可见分光光度计/酶标仪、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研钵、冰和蒸馏水。
样品酶液的制备：
1、细菌、细胞或组织样品的制备：
细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（104个）：提取液体积（ml）为500~1000：1的比例（建议500万细菌或细胞加入1ml提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率20％或200W，超声3s，间隔10s，重复30次）；8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。
组织：按照组织质量（g）：提取液体积(ml)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1ml提取液），进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。
2、血清（浆）样品：直接检测。
操作步骤：
1、分光光度计或酶标仪预热30min以上，调节波长至660nm，蒸馏水调零。
2、酶促反应（在EP管中加入下列试剂）：
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对照管
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测定管
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试剂一（μl）
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65
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45
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试剂二（μl）
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60
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60
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试剂三（μl）
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20
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样本 （μl）
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100
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混匀，37℃（哺乳动物）或25℃（其他物种）准确水浴10min
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试剂四（μl）
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25
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25
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样本 （μl）
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100
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混匀，8000g，25℃离心10min，取上清液
3、定磷（在EP管或96孔板中加入下列试剂）
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空白管
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标准管
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对照管
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测定管
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0.5μmol/ml标准磷应用液（μl）
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20
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上清液（μl）
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20
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20
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蒸馏水（μl）
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20
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定磷试剂（μl）
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200
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200
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200
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200
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混匀，室温放置30min，在 660nm处，记录各管吸光值。
注意:
1、由于每一个样都必须做对照，本试剂盒100管保证测 48份Na+K+-ATP酶。
2、此法具有微量、灵敏、快速的特点。所以对测定所用试管要求严格无磷。
3、空白管和标准管只要做一管。
计算:
1、血清（浆）Na+K+- ATPase活力的计算:
定义：每小时每毫升血清（浆）中Na+K+- ATP 酶分解ATP 产生1μmol无机磷的量为一个酶活力单位。
Na+K+-ATP酶活力（μmol/h/ml）=[C标准管×V总]×（A测定管-A对照管）÷（A标准管-A空白管）÷V样÷T=7.5×（A测定管-A对照管）÷（A标准管-A空白管）
2、组织、细菌或细胞中Na+K+- ATPase活力的计算：
（1）按蛋白浓度计算：
定义：每小时每毫克组织蛋白中Na+K+- ATP 酶分解ATP 产生1μmol无机磷的量为一个酶活力单位。
Na+K+-ATP酶活力(μmol/h /mg prot)=[C标准管×V总]×（A测定管-A对照管）÷（A标准管-A空白管）÷（Cpr×V样）÷T =7.5×（A测定管-A对照管）÷（A标准管-A空白管）÷Cpr
（2）按样本鲜重计算：
定义：每小时每克组织中Na+K+-ATP 酶分解ATP 产生1μmol无机磷的量为一个酶活力单位。
Na+K+-ATP酶活力(μmol/h /g 鲜重)=[ C标准管×V总]×（A测定管-A对照管）÷（A标准管-A空白管）÷(W× V样÷V样总)÷T=7.5×（A测定管-A对照管）÷（A标准管-A空白管）÷W
（3）按细菌或细胞密度计算：
定义：每小时每1万个细菌或细胞中Na+K+-ATP 酶分解ATP 产生1μmol无机磷的量为一个酶活力单位。
Na+K+-ATP酶活力(μmol/h /104 cell) =[ C标准管×V总]×（A测定管-A对照管）÷（A标准管-A空白管）÷(500×V样÷V样总)÷T=0.015×（A测定管-A对照管）÷（A标准管-A空白管）
C标准管：标准管浓度，0.5μmol/ml；V总：酶促反应总体积，0.25ml；V样：加入样本体积，0.1ml ；V样总：加入提取液体积，1ml；T：反应时间，1/6小时；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/ml；W：样本鲜重，g；500：细菌或细胞总数，500万。
