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转氢酶-1检测试剂盒(分光光度法50T/48S)
OP018
Mitochondrial Transhydrogenase-1 Activity Assay Kit (Spectrophotometry)
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OP018-50T/48S 50T/48S ¥880.00

线粒体转氢酶-1TH-1)试剂盒说明书

                                                  分光光度法 50/48

正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定                                             

测定意义:

TH位于线粒体的内膜上,又称为呼吸电子传递链复合体六,催化NADH+NADP+ NAD++NADPH相互转化。催化正向反应称为TH-1。线粒体NADH含量增加时会导致线粒体膜的H+电化学梯度升高,因而促进了电子传递链上ROS的产生。TH-1促进NADH转换为NADPH,从而提高线粒体的抗氧化能力。

测定原理:

NADHNADPH均在340nm有特征吸收,因此TH催化的转氢反应不能导致340nm吸光度发生变化。用人工合成底物3-乙酰吡啶腺嘌呤二核苷酸磷酸(APADP+)替代NADP+TH-1催化 APADP+还原生成的APADPH375nm有特征光吸收,因此通过测定375nm光吸收增加速率,来计算TH-1活性。

试剂的组成和配制:

产品名称

OP018-50T/48S

Storage

试剂一:液体

50ml

-20

试剂二:液体

25ml

-20

试剂三:液体

25ml

4℃

试剂:粉剂

2

-20

试剂五:液体

2

-20

说明书

一份

需自备的仪器和用品:

可见分光光度计、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、1mL玻璃比色皿、研钵、冰和蒸馏水。

样本的前处理:

组织、细菌或细胞中胞浆蛋白与线粒体蛋白的分离:

1、准确称取0.1g组织或收集500万细菌或细胞,加入1mL试剂一,用冰浴匀浆器或研钵匀浆。

2、将匀浆600g4℃离心5min

3、弃沉淀,将上清液移至另一离心管中,11000g4℃离心10min

4、上清液即为除去线粒体的胞浆蛋白,可用于测定从线粒体泄漏的TH-1(此步可选做)。

5、步骤4中的沉淀即为线粒体,加入500uL试剂二,超声波破碎(冰浴,功率20%或200W,超声3s,间隔10秒,重复30次),用于TH-1活性测定。

测定步骤:

1、分光光度计预热30min以上,调节波长至375nm,蒸馏水调零。

2、样本测定

1)工作液的配制:临用前取试剂三、试剂四和试剂五各一支,将试剂四、五转移到试剂三中混合溶解,置于37℃(哺乳动物)或25℃(其它物种)水浴5min;用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融。

2)在1mL玻璃比色皿中加入100μL样本和1000μL工作液,混匀,立即记录375nm处初始吸光值A110min后的吸光值A2,计算ΔA=A2-A1

TH-1活性计算:

1) 按样本蛋白浓度计算

单位的定义:每mg组织蛋白每分钟产生1 nmol APADPH定义为一个酶活性单位。

 TH-1活性(nmol/min /mg prot=[ΔA×V反总÷ε×d×109]÷(Cpr×V)÷T=164×ΔA÷Cpr

2) 按样本鲜重计算

单位的定义:每g组织每分钟产生1 nmol APADPH定义为一个酶活性单位。

TH-1活性(nmol/min/g 鲜重)=[ΔA×V反总÷ε×d×109]÷(V÷V样总×W) ÷T=82×ΔA÷W

3) 按细菌或细胞密度计算

单位的定义:每1万个细菌或细胞每分钟产生1 nmol APADPH定义为一个酶活性单位。

TH-1活性(nmol/min/104 cell=[ΔA×V反总÷ε×d×109]÷(V÷V样总×500) ÷T=0.164×ΔA

V反总:反应体系总体积,1.1×10-3 LεAPADPH摩尔消光系数,6.7×103 L / mol /cmd:比色皿光径,1cmV样:加入样本体积,0.1 mLV样总:加入提取液体积,0.5mLT:反应时间,10 minCpr:样本蛋白质浓度,mg/mLW:样本质量,g500:细菌或细胞总数,500万。

象形图
警示语
Class
警告声明
UNub
危险声明
Packing Group
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