二磷酸核酮糖羧化酶(Rubisco)试剂盒说明书
微量法 100管/96样
正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定
测定意义:
二磷酸核酮糖羧化酶(EC 4.1.1.39)是植物光合作用中的一个关键酶,既控制着CO2的固定,同时又制约着碳素向Calvin循环和光呼吸循环分流,其活性的大小直接影响着光合速率。
测定原理:
在Rubisco的催化下,1分子的核酮糖-1,5-二磷酸(RuBP)与1分子的CO2结合,产生2分子的3-磷酸甘油酸(PGA),PGA可通过外加的3-磷酸甘油酸激酶和甘油醛-3-磷酸脱氢酶的作用,产生甘油醛-3-磷酸,并使还原型辅酶I(NADH)氧化。因此,340nm吸光度的变化可计算还原型辅酶I氧化速率,还原型辅酶I氧化速率可反应Rubisco的活性。
组成:
产品名称
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PSS007-100T/96S
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Storage
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提取液一:液体
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100ml
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4℃
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提取液二:液体
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100ml
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4℃
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试剂一:液体
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25ml
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4℃
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试剂二:粉剂
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1瓶
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-20℃
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试剂三:粉剂
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1瓶
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-20℃
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试剂四:粉剂
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1瓶
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-20℃
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说明书
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一份
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试剂二:粉剂×1瓶,-20℃保存;临用前加入10ml试剂一,充分混匀待用;用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融;
试剂三:粉剂×1瓶,-20℃保存;临用前加入10ml试剂一,充分混匀待用;用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融;
试剂四:粉剂×1瓶,-20℃保存;临用前加入1 ml试剂一,充分溶解待用;用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融;
(注意:试剂二、三、四溶解后,按需分装-20℃保存。)
自备仪器和用品:
分光光度计/酶标仪、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研钵、冰和蒸馏水。
粗酶液制备:
①总Rubisco酶提取:建议称取约0.1g样本,加入1ml提取液一,冰浴匀浆后超声破碎(冰浴,200W,破碎3s,间歇7s,总时间1min),然后4℃,8000g离心10min,取上清测定。
②胞浆和叶绿体Rubisco酶的分离:按照植物组织质量(g):提取液体积(ml)为1:5~10的比例(建议称取约0.1g样本,加入1ml提取液一),冰浴匀浆后于4℃,200g离心5min,弃沉淀,取上清在4℃,8000g离心10min,取上清用于测定胞浆Rubisco酶活性,取沉淀加1ml提取液二,震荡溶解后超声破碎(冰浴,200W,破碎3s,间歇7s,总时间1min),然后4℃,8000g离心10min,取上清测定叶绿体中Rubisco酶活性。
建议测定总Rubisco酶活性,按照步骤①提取粗酶液,若需要分别测定胞浆和叶绿体中的Rubisco,则按照步骤②提取粗酶液。
(注意:粗酶液制备过程中超声破碎操作使用细胞破碎仪进行。)
测定步骤:
1、 分光光度计或酶标仪预热30min以上,调节波长至340nm,蒸馏水调零。
2、 样本测定
(1)工作液的配制:临用前将试剂二和试剂三1:1混合,用多少配多少;
(2)在微量石英比色皿或96孔板中加入10uL样本、10uL试剂四和180uL工作液,混匀,立即记录340nm处20s时吸光值A1和5min20s时的吸光值A2,计算ΔA=A1-A2。
Rubisco活性计算:
a.使用微量石英比色皿测定的计算公式如下:
1、按样本蛋白浓度计算
单位的定义:25℃中1 mg蛋白1 min氧化1 nmol NADH。
Rubisco(nmol/min /mg prot)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(V样×Cpr) ÷T =643×ΔA÷Cpr
此法需要测定粗酶液中蛋白质浓度,建议选购本公司生产的BCA蛋白质浓度测定试剂盒。
2、按样本鲜重计算
单位的定义:25℃中1 g组织1 min氧化1nmol NADH。
Rubisco(nmol/min/g 鲜重)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(W× V样÷V样总) ÷T=643×ΔA÷W
上述计算公式中各符合含义:
V反总:反应体系总体积,2×10-4 L;ε:NADH摩尔消光系数,6.22×103 L / mol /cm;d:比色皿光径,1cm;V样:加入样本体积,0.01 ml;V样总:加入提取液体积,1 ml;T:反应时间,5min;W:样本质量,g。
b.使用96孔板测定的计算公式如下:
1、按样本蛋白浓度计算
单位的定义:25℃中1 mg蛋白1 min氧化1 nmol NADH。
Rubisco(nmol/min /mg prot)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(V样×Cpr) ÷T =1286×ΔA÷Cpr
此法需要测定粗酶液中蛋白质浓度,建议选购本公司生产的BCA蛋白质浓度测定试剂盒。
2、按样本鲜重计算
单位的定义:25℃中1 g组织1 min氧化1nmol NADH。
Rubisco(nmol/min/g 鲜重)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(W× V样÷V样总) ÷T=1286×ΔA÷W
上述计算公式中各符合含义:
V反总:反应体系总体积,2×10-4 L;ε:NADH摩尔消光系数,6.22×103 L / mol /cm;d:96孔板光径,0.5cm;V样:加入样本体积,0.01ml;V样总:加入提取液体积,1 ml;T:反应时间,5 min;W:样本质量,g。