丙酮酸磷酸双激酶（PPDK)试剂盒说明书
微量法 100管/96样
正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定
测定意义：
丙酮酸磷酸双激酶（pyruvate phosphate dikinase, PPDK, EC 2.7.9.1）是C4途径和景天科酸代谢途径的限速酶，催化ATP、丙酮酸和Pi经三步反应生成磷酸烯醇式丙酮酸。该酶主要存在于C4植物的叶绿体基质中，对光合功能具有重要调节作用。
测定原理：
PPDK的逆向反应催化磷酸烯醇式丙酮酸、AMP和PPi生成丙酮酸、ATP和Pi，乳酸脱氢酶进一步催化丙酮酸和NADH生成乳酸和NAD+，在340nm测定NADH减少速率，计算PPDK活性。
组成：
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产品名称
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PSS023-100T/96S
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Storage
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提取液：液体
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100ml
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4℃
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试剂一：液体
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25ml
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4℃
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试剂二：粉剂
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2瓶
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-20℃
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试剂三：液体
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40μl
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4℃
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说明书
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一份
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试剂三 ：液体40μl×1支，4℃保存；体积较少，若沾在管壁上，临用前可低速离心后使用。
自备仪器和用品：
紫外分光光度计/酶标仪、台式离心机、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研钵、冰和蒸馏水。
样本的前处理：
按照组织质量（g）：提取液体积(ml)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1ml提取液），进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。
测定步骤和加样表：
1、 分光光度计或酶标仪预热30min以上，调节波长至340nm，蒸馏水调零。
2、 样本测定
（1）工作液的配制：临用前取试剂二一瓶加入10ml试剂一和5μl试剂三，充分混匀，置于37℃水浴5min；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。
（2）在微量石英比色皿或96孔板中加入10μl样本和190μl工作液，混匀，立即记录340nm处初始吸光值A1和37℃反应5min后的吸光值A2，计算ΔA=A1-A2。
PPDK活性计算：
a.用微量石英比色皿测定的计算公式如下
（1）按样本蛋白浓度计算
单位定义：每mg组织蛋白每分钟消耗1nmol NADH定义为一个酶活力单位。
PPDK（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷(V样×Cpr) ÷T=643×ΔA÷Cpr
（2）按样本鲜重计算
单位定义：每g组织每分钟消耗1 nmol NADH定义为一个酶活力单位。
PPDK（nmol/min/g 鲜重）＝[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷(W ×V样÷V样总)÷T=643×ΔA÷W
V反总：反应体系总体积，2×10-4 L；ε：NADH摩尔消光系数，6.22×103 L / mol /cm；d：比色皿光径，1cm；V样：加入样本体积，0.01 ml；V样总：加入提取液体积，1 ml；T：反应时间，5 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/ml；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500万。
b.用96孔板测定的计算公式如下
（1）按样本蛋白浓度计算
单位定义：每mg组织蛋白每分钟消耗1nmol NADH定义为一个酶活力单位。
PPDK（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷(V样×Cpr) ÷T=1286×ΔA÷Cpr
（2）按样本鲜重计算
单位定义：每g组织每分钟消耗1 nmol NADH定义为一个酶活力单位。
PPDK（nmol/min/g 鲜重）＝[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷(W× V样÷V样总)÷T=1286×ΔA÷W
V反总：反应体系总体积，2×10-4 L；ε：NADH摩尔消光系数，6.22×103 L / mol /cm；d：96孔板光径，0.5cm；V样：加入样本体积，0.01 ml；V样总：加入提取液体积，1 ml；T：反应时间，5 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/ml；W：样本质量，g。
