乙醇酸氧化酶(glycollic oxidase, GO)试剂盒说明书
分光光度法 50管48样
正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定
测定意义:
乙醇酸氧化酶(EC1.1.3.15)是植物光呼吸代谢中的关键酶,也是光下合成草酸的关键酶,它催化乙醇酸氧化生成乙醛酸,对研究光呼吸代谢过程及其调控具有重要意义。
测定原理:
乙醇酸氧化酶催化乙醇酸氧化生成乙醛酸,乙醛酸和盐酸苯肼反应生成乙醛酸苯腙,在324nm有特征吸收峰。
组成:
产品名称
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PSS020-50T/48S
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Storage
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提取液:液体
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50ml
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4℃
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试剂一:液体
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35ml
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4℃
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试剂二:粉剂
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1瓶
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4℃避光
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试剂三:液体
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5ml
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4℃
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说明书
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一份
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试剂二:粉剂×1瓶,4℃避光保存,临用前加10ml双蒸水溶解;用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融。
自备仪器和用品:
天平、低温离心机、紫外分光光度计、1ml石英比色皿。
酶液提取:
按照组织质量(g):提取液体积(ml)为1:5~10的比例(建议称取约0.1g组织,加入1ml提取液),进行冰浴匀浆。12000g, 4℃离心10min,取上清,置冰上待测。
测定步骤:
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测定管
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样本(μl)
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50
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试剂一(μl)
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650
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试剂二(μl)
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200
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试剂三(μl)
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100
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充分混匀,立即于1ml石英比色皿中测定324nm处10s和190s吸光值A1和A2,△A=A2- A1
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酶活性计算公式
1.按照蛋白浓度计算
酶活性定义:每毫克蛋白每分钟氧化1 nmol乙醇酸所需的酶量为一个酶活力单位。
GO活性(nmol/min /mg prot)= ×V反总÷(V样×Cpr)÷T= 392×△A÷Cpr
2.按照样本质量计算
酶活性定义:每克组织每分钟氧化1 nmol乙醇酸所需的酶量为一个酶活力单位。
GO活性(nmol/min /g 鲜重)= ×V反总÷(V样×W÷V样总)÷T= 392×△A÷W
ε:乙醛酸苯腙毫摩尔消光系数:17L/mmol/cm;d:比色皿光径,1cm;V反总:反应总体积,1ml;V样:反应中样本体积,0.05ml;V样总:加入提取液体积,1ml;Cpr:样本蛋白浓度,mg/ml;W,样本质量,g;T:反应时间,3min
注意事项:
1. 测定之前进行预实验,若吸光值较高,请将样品用提取液进行适当的稀释再测定,并在计算公式中乘以稀释倍数。
2. 色素含量较高的样品,可在提取酶时加活性炭吸附。