磷脂酶D（ Phospholipases D，PLD ）试剂盒说明书
微量法100T/96S
正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定
测定意义：
磷脂酶D（EC3.1.4.4）即磷脂酰胆碱水解酶，是催化磷酸二酯键水解和碱基交换反应的一类酶的总称，广泛存在于高等动植物和细菌等多种生物体中，具有参与细胞脂质代谢、信号传导、生物膜形成的抗逆境胁等生理功能。
测定原理：
磷脂酶D催化水解磷脂酰胆碱末端的磷脂酰二酯键生成磷脂酸和胆碱，胆碱在胆碱氧化酶催化作用下生成甜菜碱和过氧化氢，过氧化氢在过氧化氢酶的作用下将4-氨基安替比林和重蒸酚氧化成粉红色物质，在500nm处有特征吸收峰。
组成：
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产品名称 |
FA026-100T/96S |
Storage |
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提取液：液体 |
100ml |
4℃ |
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试剂一：液体 |
102ml |
4℃避光 |
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试剂二：液体 |
3ml |
4℃避光 |
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试剂三：粉剂 |
1支 |
-20℃避光 |
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试剂四：液体 |
15ml |
4℃避光 |
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标准品：液体 |
1ml |
4℃避光 |
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说明书 |
一份 |
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试剂三：粉剂×1支，-20℃避光保存。临用前加1ml无水乙醇充分溶解；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。
自备仪器和用品：
天平、研钵、超速冷冻离心机、可见分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔板、恒温水浴锅、无水乙醇。
酶液提取：
1. 组织：按照质量（g）：提取液体积(ml)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g，加入1ml提取液）加入提取液，冰浴匀浆后于4℃，10000g离心5min，取全部上清于4℃、100000g离心30min，弃上清，取沉淀溶于1ml试剂一。
2. 细胞：按照细胞数量（104个）：提取液体积（ml）为500~1000：1的比例（建议500万细胞加入1ml提取液），冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声3秒，间隔7秒，总时间3min）；然后于4℃，10000g离心5min，取全部上清于4℃、100000g离心30min，弃上清，取沉淀溶于1ml试剂一。
3. 血清：直接测定。
测定操作：
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空白管 |
标准管 |
测定管 |
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试剂一（μl） |
20 |
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试剂二（μl） |
30 |
30 |
30 |
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标准品（μl） |
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20 |
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样品（μl） |
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20 |
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试剂三（μl） |
10 |
10 |
10 |
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充分混匀，30℃反应30min，沸水浴1min，打开盖子，自然冷却2min。 |
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试剂四（μl） |
140 |
140 |
140 |
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30℃反应30min，于微量石英比色皿/96孔板，空白管调零，测定500nm处吸光值，分别记为A标准管和A测定管。 |
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酶活计算公式：
a. 用微量石英比色皿测定的计算公式如下
1．按照蛋白浓度计算
酶活性定义：每毫克蛋白每分钟水解磷脂酰胆碱产生1nmol胆碱所需的酶量为一个酶活力单位。
PLD活性（nmol/min /mg prot）= 
×C标准÷Cpr÷T= 16.7×
÷Cpr
2．按照样本质量计算
酶活性定义：每克组织每分钟水解磷脂酰胆碱产生1nmol胆碱所需的酶量为一个酶活力单位。
PLD活性（nmol/min /g 鲜重）= 
×C标准÷W÷T = 16.7×
÷W
3．按照细胞数量计算
酶活性定义：每104个细胞每分钟水解磷脂酰胆碱产生1nmol胆碱所需的酶量为一个酶活力单位。
PLD活性（nmol/min /104 cell）= 
×C标准÷细胞数量÷T = 16.7×
÷细胞数量
4．按照液体体积计算
酶活性定义：每毫升血清每分钟水解磷脂酰胆碱产生1nmol胆碱所需的酶量为一个酶活力单位。
PLD活性（nmol/min /ml）= 
×C标准÷T=16.7×
C标准：标准品浓度，500nmol/ml；Cpr：样本蛋白浓度，mg/ml；W：样本质量，g/ml；T：反应时间，30min
b. 用96孔板测定的计算公式如下
1．按照蛋白浓度计算
酶活性定义：每毫克蛋白每分钟水解磷脂酰胆碱产生1nmol胆碱所需的酶量为一个酶活力单位。
PLD活性（nmol/min /mg prot）= 
×C标准÷Cpr÷T= 16.7×
÷Cpr
2．按照样本质量计算
酶活性定义：每克组织每分钟水解磷脂酰胆碱产生1nmol胆碱所需的酶量为一个酶活力单位。
PLD活性（nmol/min /g 鲜重）= 
×C标准÷W÷T = 16.7×
÷W
3．按照细胞数量计算
酶活性定义：每104个细胞每分钟水解磷脂酰胆碱产生1nmol胆碱所需的酶量为一个酶活力单位。
PLD活性（nmol/min /104 cell）= 
×C标准÷细胞数量÷T = 16.7×
÷细胞数量
4．按照液体体积计算
酶活性定义：每毫升血清每分钟水解磷脂酰胆碱产生1nmol胆碱所需的酶量为一个酶活力单位。
PLD活性（nmol/min /ml）= 
×C标准÷T=16.7×
C标准：标准品浓度，500nmol/ml；Cpr：样本蛋白浓度，mg/ml；W：样本质量，g/ml；T：反应时间，30min
注意事项：
1. 显色完成后，若有沉淀，于8000rpm，25℃离心5min后取上清测定。
2. 吸光值不宜超过1，否则用试剂一将酶液进行稀释，并在计算公式中乘以稀释倍数。
| 象形图 | |
|---|---|
| 警示语 | |
| Class | |
| 警告声明 | |
| UNub | |
| 危险声明 | |
| Packing Group |
| FA026 磷脂酶D（ PLD ）检测试剂盒（微量法100T96S）.pdf | 下载 |
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