磷脂酶C（ Phospholipases C，PLC ）试剂盒说明书
微量法100T/96S
正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定
测定意义：
磷脂酶C（EC3.1.4.3）是一种水解甘油磷酸酯C3位点甘油磷酸酯键的脂类水解酶，广泛存在于微生物及动植物的组织和细胞中，在细胞代谢、细胞传递、生长发育等方面具有重要作用。
测定原理：
磷脂酶C催化水解NPPC产生对硝基苯酚，在410nm处有特征吸收峰。
组成：
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产品名称
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FA028-100T/96S
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Storage
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提取液：液体
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100ml
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4℃
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试剂一：液体
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102ml
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4℃
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试剂二：液体
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10ml
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4℃避光
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试剂三：液体
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8ml
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4℃
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说明书
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一份
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自备仪器和用品：
天平、研钵、超速冷冻离心机、可见分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔板、恒温水浴锅。
酶液提取:
1. 组织：按照质量（g）：提取液体积(ml)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g，加入1ml提取液）加入提取液，冰浴匀浆后于4℃，10000g离心5min，取全部上清于4℃、100000g离心30min，弃上清，取沉淀溶于1ml试剂一。
2. 细胞：按照细胞数量（104个）：提取液体积（ml）为500~1000：1的比例（建议500万细胞加入1ml提取液），冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声3秒，间隔7秒，总时间3min）；然后于4℃，10000g离心5min，取全部上清于4℃、100000g离心30min，弃上清，取沉淀溶于1ml试剂一。
3. 血清：直接测定。
测定操作:
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空白管
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测定管
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样品（μl）
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20
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试剂一（μl）
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20
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试剂二（μl）
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100
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100
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充分混匀，37℃反应30min
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试剂三（μl）
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80
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80
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充分混匀，于微量石英比色皿/96孔板，蒸馏水调零，测定410nm处吸光值，分别记为A空白管和A测定管，△A=A测定管-A空白管。
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酶活计算公式:
a. 用微量石英比色皿测定的计算公式如下
标准曲线：y = 0.0191x - 0.0103，R2 = 0.9991
1．按照蛋白浓度计算
酶活性定义：每毫克蛋白每分钟水解NPPC产生1nmol对硝基苯酚所需的酶量为一个酶活力单位。
PLC活性（nmol/min/mg prot）=（△A+0.0103）÷ 0.0191×V反总÷(V样×Cpr) ÷T
= 17.45×（△A+0.0103）÷ Cpr
2．按照样本质量计算
酶活性定义：每克组织每分钟水解NPPC产生1nmol对硝基苯酚所需的酶量为一个酶活力单位。
PLC活性（nmol/min/g 鲜重）=（△A+0.0103）÷ 0.0191×V反总÷(V样÷V样总×W) ÷T
= 17.45×（△A+0.0103）÷ W
3．按照细胞数量计算
酶活性定义：每104个细胞每分钟水解NPPC产生1nmol对硝基苯酚所需的酶量为一个酶活力单位。
PLC活性（nmol/min/104 cell）=（△A+0.0103）÷ 0.0191×V反总÷(V样÷V样总×细胞数量) ÷T
= 17.45×（△A+0.0103）÷ 细胞数量
4．按照液体体积计算
酶活性定义：每毫升血清每分钟水解NPPC产生1nmol对硝基苯酚所需的酶量为一个酶活力单位。
PLC活性（nmol/min/ml）= （△A+0.0103）÷ 0.0191×V反总÷V样÷T
= 17.45×（△A+0.0103）
V反总：反应总体积，0.2ml；V样：加入样本体积，0.02ml；V样总：加入提取液体积，1ml；Cpr：样本蛋白浓度，mg/ml；W：样本质量，g；T：反应时间，30min
b. 用96孔板测定的计算公式如下
标准曲线：y = 0.0095x - 0.0103，R2 = 0.9991
1．按照蛋白浓度计算
酶活性定义：每毫克蛋白每分钟水解NPPC产生1nmol对硝基苯酚所需的酶量为一个酶活力单位。
PLC活性（nmol/min/mg prot）=（△A+0.0103）÷ 0.0095×V反总÷(V样×Cpr) ÷T
= 35.09×（△A+0.0103）÷ Cpr
2．按照样本质量计算
酶活性定义：每克组织每分钟水解NPPC产生1nmol对硝基苯酚所需的酶量为一个酶活力单位。
PLC活性（nmol/min/g 鲜重）=（△A+0.0103）÷ 0.0095×V反总÷(V样÷V样总×W) ÷T
= 35.09×（△A+0.0103）÷ W
3．按照细胞数量计算
酶活性定义：每104个细胞每分钟水解NPPC产生1nmol对硝基苯酚所需的酶量为一个酶活力单位。
PLC活性（nmol/min/104 cell）=（△A+0.0103）÷ 0.0095×V反总÷(V样÷V样总×细胞数量) ÷T
=35.09×（△A+0.0103）÷ 细胞数量
4．按照液体体积计算
酶活性定义：每毫升血清每分钟水解NPPC产生1nmol对硝基苯酚所需的酶量为一个酶活力单位。
PLC活性（nmol/min/ml）= （△A+0.0103）÷ 0.0095×V反总÷V样÷T
= 35.09×（△A+0.0103）
V反总：反应总体积，0.2ml；V样：加入样本体积，0.02ml；V样总：加入提取液体积，1ml；Cpr：样本蛋白浓度，mg/ml；W：样本质量，g；T：反应时间，30min
