谷氨酰胺酶(glutaminase, GLS) 活性测定试剂盒说明书
分光光度法 50管/48样
正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定
测定意义:
GLS(EC 3.5.1.1)是酰胺基水解酶,催化天冬酰胺水解成谷氨酸和氨,在氮素代谢中具有重要调控作用,尤其是调节游离氨含量和尿素代谢。
测定原理:
GLS催化谷氨酰胺水解成L-谷氨酸和氨,利用奈氏试剂检测氨增加的速率,即可计算其酶活性。
组成:
产品名称
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NM005-50T/48S
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Storage
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试剂一:液体
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60 ml
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4℃
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试剂二:液体
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20 ml
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4℃
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试剂三:液体
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30 ml
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常温
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试剂四:液体
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10 ml
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常温
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试剂五:液体
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6 ml
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常温
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试剂六:液体
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6 ml
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常温避光
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说明书
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一份
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自备仪器和用品:
台式离心机、可见分光光度计、水浴锅、1ml玻璃比色皿、可调式移液枪、研钵、冰和蒸馏水。
粗酶液提取:
1、细菌、细胞或组织样品的制备:
细菌或培养细胞:先收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;按照细菌或细胞数量
(104个):试剂一体积(ml)为500~1000:1的比例(建议500万细菌或细胞加入1ml试剂一),超声波破碎细菌或细胞(冰浴,功率20%或200W,超声3s,间隔10s,重复30次);
8000g4℃离心10min,取上清,置冰上待测。
组织:按照组织质量(g):试剂一体积(ml)为1:5~10的比例(建议称取约0.1g组织,
加入1ml试剂一),进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心10min,取上清,置冰上待测。
2、血清(浆)样品:直接检测。
测定步骤:
1、分光光度计预热30min以上,调节波长至420nm,蒸馏水调零。
2、样品测定(在EP中加入下列试剂):
试剂名称(μl)
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测定管
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对照管
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样本
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25
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蒸馏水
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25
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试剂一
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100
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100
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试剂二
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400
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400
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混匀,37℃水浴1 小时
混匀,8000 g,25℃离心10 min;取上清液,在EP管中加入下列试剂
上清液
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650
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650
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试剂四
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150
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150
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试剂五
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100
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100
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试剂六
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100
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100
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混匀,室温静置15min,420nm处读取吸光值A,计算ΔA=A测定管-A对照管。对照管只要做一管。
注意:
1、试剂六如出现沉淀,静置后取上清使用。
2、ΔA(A测定管-A对照管)若出现负值,可能是酶活性较低,可将反应时间1h延长到2h,相应的在计算公式中除以2。
酶活性计算:
标准条件下测定的回归方程为y =3.8488x +0.0057,R2 = 0.9983;;x为标准品浓度(μmol/ml),y为吸光值A。
1、血清(浆)GLS活性
单位定义:每ml血清(浆)每min催化谷氨酰胺生成1nmol 氨定义为一个酶活力单位。GLS(nmol /min /ml)= (ΔA-0.0057) ÷3.8488×V反总÷V样÷T×1000=181.8×(ΔA -0.0057)
2、组织、细菌或细胞GLS活性
(1)按样本蛋白浓度计算:
单位定义:每mg蛋白质每min催化谷氨酰胺生成1nmol 氨定义为一个酶活力单位。
GLS(nmol /min /mg prot)= (ΔA-0.0057) ÷3.8488×V反总÷(V样×Cpr)÷T×1000=181.8×(ΔA -0.0057)÷Cpr
(2)按样本鲜重计算:
单位定义:每g组织每min催化谷氨酰胺生成1nmol 氨定义为一个酶活力单位。
GLS(nmol/min/g 鲜重)=(ΔA-0.0057)÷3.8488×V反总÷(W×V样÷V样总)÷T×1000
=181.8×(ΔA -0.0057)÷W
(3)按细菌或细胞密度计算
单位定义:每1万个细菌或细胞每min催化谷氨酰胺生成1nmol 氨定义为一个酶活力单位。GLS(nmol/min/104 cell)=(ΔA-0.0057) ÷3.8488×V反总÷(500× V样÷V样总)÷T×1000
=0.3637×(ΔA-0.0057)
V样总:加入提取液体积,1 ml;T:反应时间,60min;V反总:反应体系总体积,1.05ml;V样:加入反应体系中样本体积,0.025ml;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/ml;W:样本质量,g;500:细菌或细胞总数,500万; 1000,μmol到nmol换算系数。