谷氨酰胺酶(glutaminase, GLS) 活性测定试剂盒说明书
微量法 100管/96样
正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定
测定意义：
GLS（EC 3.5.1.1）是酰胺基水解酶，催化天冬酰胺水解成谷氨酸和氨，在氮素代谢中具有重要调控作用，尤其是调节游离氨含量和尿素代谢。
测定原理：
GLS催化谷氨酰胺水解成L-谷氨酸和氨，利用奈氏试剂检测氨增加的速率，即可计算其酶活性。
组成：
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产品名称
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NM006-100T/96S
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Storage
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试剂一：液体
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60 ml
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4℃
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试剂二：液体
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40 ml
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4℃
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试剂三：液体
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60 ml
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常温
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试剂四：液体
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5 ml
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常温
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试剂五：液体
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3 ml
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常温
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试剂六：液体
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3 ml
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常温避光
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说明书
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一份
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自备仪器和用品：
台式离心机、酶标仪、96孔板、可调式移液枪、研钵、冰和双蒸水。
粗酶液提取：
1、细菌、细胞或组织样品的制备：
细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（104个）：试剂一体积（ml）为500~1000：1的比例（建议500万细菌或细胞加入1ml试剂一），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率20％或200W，超声3s，间隔10s，重复30次）；8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。
组织：按照组织质量（g）：试剂一体积(ml)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1ml试剂一），进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。
2、血清（浆）样品：直接检测。
测定步骤：
1、酶标仪预热30min以上，调节波长至420nm。
2、样品测定（在EP管中加入下列试剂）：
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试剂名称（μl）
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测定管
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对照管
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样本
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25
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蒸馏水
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25
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试剂一
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100
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100
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试剂二
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400
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400
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混匀，37℃水浴1 小时
混匀，8000 g，25℃离心10 min；取上清液，在96孔板中加入下列试剂
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上清液
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130
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130
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试剂四
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30
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30
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试剂五
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20
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20
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试剂六
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20
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20
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混匀，室温静置15min，420nm处读取测定管和对照管吸光值，计算ΔA=A测定管-A对照管。对照管只要做一管。
注意：
1、试剂六如出现沉淀，静置后取上清使用。
2、ΔA（A测定管-A对照管）若出现负值，可能是酶活性较低，可将反应时间1h延长到2h，相应的在计算公式中除以2。
酶活性计算：
标准条件下测定的回归方程为y = 1.9244x + 0.0057，R2 = 0.9983；x为标准品浓度（μmol/ml），y为吸光值A。
1、血清（浆）GLS活性
单位定义：每ml血清（浆）每min催化谷氨酰胺生成1nmol 氨定义为一个酶活力单位。GLS(nmol /min /ml)＝ (ΔA-0.0057) ÷1.9244×V反总÷V样÷T×1000=363.7×(ΔA -0.0057)
2、组织、细菌或细胞GLS活性
（1）按样本蛋白浓度计算：
单位定义：每mg蛋白质每min催化谷氨酰胺生成1nmol 氨定义为一个酶活力单位。
GLS(nmol /min /mg prot)＝ (ΔA-0.0057) ÷1.9244×V反总÷(V样×Cpr)÷T×1000=363.7×(ΔA -0.0057)÷Cpr。
（2）按样本鲜重计算：
单位定义：每g组织每min催化谷氨酰胺生成1nmol 氨定义为一个酶活力单位。
GLS(nmol/min /g 鲜重)＝(ΔA-0.0057)÷1.9244×V反总÷(W×V样÷V样总)÷T×1000=363.7×(ΔA -0.0057)÷W。
（3）按细菌或细胞密度计算
单位定义：每1万个细菌或细胞每min催化谷氨酰胺生成1nmol 氨定义为一个酶活力单位。GLS(nmol/min/104 cell)＝(ΔA-0.0057)÷1.9244×V反总÷(500×V样÷V样总) ÷T ×1000 =0.7274×(ΔA -0.0057)
V样总：加入提取液体积，1 ml；T：反应时间，60min；V反总：反应体系总体积，1.05ml；V样：加入反应体系中样本体积，0.025ml；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/ml；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500万; 1000，μmol到nmol换算系数。
