果胶酶（pectinase）试剂盒说明书
微量法100T/48S
正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定
测定意义：
果胶酶（pectinase）是一类分解果胶质酶类的总称，包括原果胶酶，果胶酯酶，多聚半乳糖醛酸酶和果胶裂解酶四大类，广泛存在于植物果实和微生物中，主要用于食品、酿酒、环保、医药、纺织及日化用品行业。
测定原理：
果胶酶水解果胶生成半乳糖醛酸，具有还原性醛基，与DNS试剂反应生成红棕色物质，在540nm有特征吸收峰，测定540nm处吸光值变化可计算得果胶酶活性。
试剂组成和配制：
|
产品名称
|
PCS008-100T/48S
|
Storage
|
|
提取液：液体
|
100ml
|
4℃
|
|
试剂一：液体
|
20ml
|
4℃
|
|
试剂二：粉剂
|
2瓶
|
4℃
|
|
试剂三：液体
|
20ml
|
4℃避光
|
|
说明书
|
一份
|
试剂二：粉剂×2瓶，4℃保存；临用前加入7.5ml试剂一，50℃加热溶解，用不完的试剂4℃保存一周。
需自备仪器和用品：
天平、低温离心机、可见分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔板、恒温水浴锅。
酶液提取：
1、组织：按照组织质量（g）：提取液体积(ml)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1ml提取液），进行冰浴匀浆。10000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。
2、细菌、真菌：按照细胞数量（104个）：提取液体积（ml）为500~1000：1的比例（建议500万细胞加入1ml提取液），冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声3秒，间隔7秒，总时间3min）；然后10000g，4℃离心10min，取上清置于冰上待测。
3、细胞培养液等：直接检测。
测定步骤：
50℃水浴温育5min
混匀，50℃水浴反应30min
沸水浴5min，冰浴冷却终止反应，8000g，4℃，离心10min，蒸馏水调零，取上清于微量石英比色皿或96孔板测定540nm处吸光值A，△A=A测定管-A对照管。每个测定管需设一个对照管。
注意事项：
1、试剂二若有沉淀析出，请置于50℃加热溶解。
2、测定之前请先做预实验，如果吸光值较高或较低，请用提取液做适当的稀释或者加大样本量，并在计算公式中乘以稀释倍数或者以实际加入的样本体积参与计算。
煮沸样本建议在沸水中煮沸10分钟，以将酶彻底灭活。
酶活性计算公式：
a.用微量石英比色皿测定的计算公式如下
标准曲线：y = 3.9642x - 0.008；R2 = 0.9996；x为标准品浓度，mg/ml；y为吸光值。
1．按照蛋白浓度计算
酶活性定义：在50℃，pH3.5条件下，每毫克蛋白每小时分解果胶产生1mg半乳糖醛酸为一个酶活力单位。
果胶酶活性（mg/h/mg prot）= (ΔA+0.008) ÷3.9642×V反总÷（V样×Cpr）÷T
= 2.523×(ΔA+0.008)÷Cpr
2．按照样本质量计算
酶活性定义：在50℃，pH3.5条件下，每克样本每小时分解果胶产生1mg半乳糖醛酸为一个酶活力单位。
果胶酶活性（mg/h /g 鲜重）=(ΔA+0.008) ÷3.9642×V反总÷（V样×W÷V样总）÷T
= 2.523×(ΔA+0.008)÷W
3. 按细胞数量计算
酶活性定义：在50℃，pH3.5条件下，每104细胞每小时分解果胶产生1mg半乳糖醛酸为一个酶活力单位。
果胶酶活性（mg/h /104cell）=(ΔA+0.008) ÷3.9642×V反总÷（V样×细胞数量÷V样总）÷T
= 2.523×(ΔA+0.008)÷细胞数量
4．细胞培养液
酶活性定义：在50℃，pH3.5条件下，每毫升培养液每小时分解果胶产生1mg半乳糖醛酸为一个酶活力单位。
果胶酶活性（mg/h /ml）=(ΔA+0.008) ÷3.9642×V反总÷V样÷T=2.523×(ΔA+0.008)
V反总：反应总体积，0.15ml；V样：反应中样本体积，0.03ml；V样总：加入提取液体积，1ml；Cpr：样本蛋白浓度，mg/ml；W，样本质量，g；T：反应时间，0.5h
b.用96孔板测定的计算公式如下
标准曲线：y = 1.9821x - 0.008，R2 = 0.9996；x为标准品浓度，mg/ml；y为吸光值。
1．按照蛋白浓度计算
酶活性定义：在50℃，pH3.5条件下，每毫克蛋白每小时分解果胶产。生1mg半乳糖醛酸为一个酶活力单位。
果胶酶活性（mg/h/mg prot）=(ΔA+0.008) ÷1.9821×V反总÷（V样×Cpr）÷T
= 5.045×(ΔA+0.008)÷Cpr
2．按照样本质量计算
酶活性定义：在50℃，pH3.5条件下，每克样本每小时分解果胶产生1mg半乳糖醛酸为一个酶活力单位。
果胶酶活性（mg/h/g 鲜重）=(ΔA+0.008) ÷1.9821×V反总÷（V样×W÷V样总）÷T
= 5.045×(ΔA+0.008)÷W
3. 按细胞数量计算
酶活性定义：在50℃，pH3.5条件下，每104细胞每小时分解果胶产生1mg半乳糖醛酸为一个酶活力单位。
果胶酶活性（mg/h /104cell）=(ΔA+0.008) ÷1.9821×V反总÷（V样×细胞数量÷V样总）÷T
= 5.045×(ΔA+0.008)÷细胞数量
4．细胞培养液
酶活性定义：在50℃，pH3.5条件下，每毫升培养液每小时分解果胶产生1mg半乳糖醛酸为一个酶活力单位。
果胶酶活性（mg/h/ml）=(ΔA+0.008) ÷1.9821×V反总÷V样÷T=5.045×(ΔA+0.008)
V反总：反应总体积，0.15ml；V样：反应中样本体积，0.03ml；V样总：加入提取液体积，1ml；Cpr：样本蛋白浓度，mg/ml；W，样本质量，g；T：反应时间，0.5h
