丙酮酸脱氢酶（Pyruvate dehydrogenase，PDH）试剂盒说明书
分光光度法 50管/48样
正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定
测定意义：
PDH（EC 1.2.4.1）广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，是丙酮酸脱氢酶复合体(PDHC)催化丙酮酸氧化脱羧的限速酶，催化丙酮酸脱梭生成羟乙基-TPP，把糖酵解和三羧酸循环连接起来。
测定原理：
PDH催化丙酮酸脱氢，同时还原2,6-二氯酚靛酚（2,6-DCPIP），从而导致600nm光吸收的减少。
组成：
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产品名称
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KC003-50T/48S
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Storage
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试剂一：液体
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50ml
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-20℃
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试剂二：液体
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10ml
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-20℃
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试剂三：液体
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1ml
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-20℃
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试剂四：液体
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50ml
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4℃
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试剂五：粉剂
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1支
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4℃
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试剂六：粉剂
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1支
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4℃
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试剂七：粉剂
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1支
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4℃
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试剂八：粉剂
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1支
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4℃
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说明书
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一份
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工作液的配制：临用前把试剂五、试剂六、试剂七和试剂八转移到试剂四中混合溶解待用；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。
自备仪器和用品：
可见分光光度计、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、1 ml玻璃比色皿、研钵、冰和蒸馏水。
样本的前处理：
组织、细菌或细胞中胞浆蛋白与线粒体蛋白的分离：
1、 称取约0.1g组织或收集500万细菌或细胞，加入1ml试剂一和10μl 试剂三，用冰浴匀浆器或研钵匀浆。
2、 将匀浆600g，4℃离心5min。
3、 弃沉淀，将上清液移至另一离心管中，11000g，4℃离心10min。
4、 上清液即胞浆提取物，可用于测定从线粒体泄漏的PDH（此步可选做）。
5、 在步骤④的沉淀中加入200μl试剂二和2μl 试剂三，超声波破碎（冰浴，功率20％或200W，超声3秒，间隔10秒，重复30次），用于线粒体PDH活性测定。
测定步骤：
1、 分光光度计预热30min以上，调节波长至605nm处，蒸馏水调零。
2、工作液于37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）中孵育5min。
3、在1ml玻璃比色皿中加入50μl样本和900μl工作液，混匀，立即记录605nm处初始吸光值A1和1min后的吸光值A2，计算ΔA=A1-A2。
PDH活性计算：
（1） 按样本蛋白浓度计算
单位的定义：每mg组织蛋白每分钟消耗1 nmol 2,6-二氯酚靛酚定义为一个酶活性单位。
PDH活性（nmol/min /mg prot）＝[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷(V样×Cpr) ÷T=905×ΔA÷Cpr
（2） 按样本鲜重计算
单位的定义：每g组织每分钟消耗1 nmol 2,6-二氯酚靛酚定义为一个酶活性单位。
PDH活性（nmol/min/g 鲜重）＝[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷(W× V样÷V样总) ÷T=182.8×ΔA÷W
（3） 按细菌或细胞密度计算
单位的定义：每1万个细菌或细胞每分钟消耗1 nmol 2,6-二氯酚靛酚定义为一个酶活性单位。
PDH活性（nmol/min /104 cell）＝[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷(500×V样÷V样总)÷T=0.366×ΔA
V反总：反应体系总体积，9.5×10-4 L；ε：2,6-二氯吲哚酚摩尔消光系数，2.1×104 L / mol /cm；d：比色皿光径，1cm；V样：加入样本体积，0.05 ml；V样总：加入提取液体积，0.202 ml；T：反应时间，1 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/ml；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500万。
