琥珀酸脱氢酶（Succinate Dehydrogenase，SDH）试剂盒说明书
分光光度法 50管/48样
正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定
测定意义：
SDH（EC 1.3.5.1）广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中。SDH是线粒体的一种标志酶，位于线粒体内膜上的一种膜结合酶，是连接呼吸电子传递和氧化磷酸化的枢纽之一。此外，为多种原核细胞产能的呼吸链提供电子。
测定原理：
SDH催化琥珀酸脱氢生成延胡索酸，脱下的氢通过吩嗪二甲酯硫酸（PMS）传递还原2,6-二氯酚靛酚（DCPIP），并且在600nm处具有特征吸收峰，通过600nm吸光度的变化，测定2．6-DPIP的还原速度，代表SDH酶活性。
组成：
|
产品名称
|
KC006-50T/48S
|
Storage
|
|
试剂一：液体
|
50ml
|
-20℃
|
|
试剂二：液体
|
10ml
|
-20℃
|
|
试剂三：液体
|
1ml
|
-20℃
|
|
试剂四：液体
|
5ml
|
4℃
|
|
试剂五：粉剂
|
1支
|
4℃
|
|
试剂六：粉剂
|
1支
|
-20℃
|
|
说明书
|
一份
|
试剂五：粉剂×1支，4℃保存，临用前加入2ml蒸馏水，用不完的试剂仍4℃保存；
试剂六：粉剂×1支，-20℃保存；临用前加入2ml蒸馏水，用不完的试剂4℃保存。
自备仪器和用品：
可见分光光度计、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、1 ml玻璃比色皿、研钵、冰和蒸馏水。
样本的前处理：
组织、细菌或细胞中胞浆蛋白与线粒体蛋白的分离：
1、 称取约0.1g组织或收集500万细菌或细胞，加入1ml试剂一和10μl 试剂三，用冰浴匀浆器或研钵匀浆。
2、 将匀浆600g，4℃离心5min。
3、 弃沉淀，将上清液移至另一离心管中，11000g，4℃离心10min。
4、 上清液即胞浆提取物，可用于测定从线粒体泄漏的SDH（此步可选做）。
在步骤④的沉淀中加入200μl试剂二和2μl 试剂三，超声波破碎（冰浴，功率20％或200W，超声3秒，间隔10秒，重复30次），用于线粒体SDH活性测定。
测定步骤和加样表：
|
试剂名称（μl）
|
测定管
|
|
试剂四
|
60
|
|
试剂五
|
30
|
|
蒸馏水
|
800
|
37℃(哺乳动物)或25℃（其它物种）保温10min左右
用蒸馏水调零后，依次加各试剂到1 ml玻璃比色皿中，在加入试剂六的同时开始计时，混匀，在600 nm波长下记录20秒时的初始吸光度A1和1分20秒时的吸光度A2，计算ΔA=A1-A2。
SDH活性的计算：
（1） 按样本蛋白浓度计算
单位的定义：每mg组织蛋白每分钟消耗1 nmol 2,6-二氯酚靛酚定义为一个酶活性单位。
SDH活性（nmol/min /mg prot）＝[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷(Cpr×V样) ÷T=1508×ΔA÷Cpr
（2） 按样本鲜重计算
单位的定义：每g组织每分钟消耗1 nmol 2,6-二氯酚靛酚定义为一个酶活性单位。
SDH活性（nmol/min/g 鲜重）＝[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷(W× V样÷V样总) ÷T=304.6×ΔA÷W
（3） 按细菌或细胞密度计算
单位的定义：每1万个细菌或细胞每分钟消耗1 nmol 2,6-二氯酚靛酚定义为一个酶活性单位。
SDH活性（nmol/min /104 cell）＝[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷(500×V样÷V样总)÷T=0.609×ΔA
V反总：反应体系总体积，9.5×10-4 L；ε：2,6-二氯吲哚酚摩尔消光系数，2.1×104 L / mol /cm；d：比色皿光径，1cm；V样：加入样本体积，0.03 ml；V样总：加入提取液体积，0.202 ml；T：反应时间，1 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/ml；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500万。
