顺乌头酸酶（ACO）活性检测试剂盒说明书
微量法 100管/96样
正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定
测定意义：
顺乌头酸酶（aconitase），三羧酸循环中的酶，催化柠檬酸转变为异柠檬酸。柠檬酸本身不易氧化，在顺乌头酸酶作用下，通过脱水与加水反应，使羟基由β碳原子转移到α碳原子上，生成易于脱氢氧化的异柠檬酸，为进一步的氧化脱羧反应作准备。
测定原理：
ACO催化柠檬酸转化成异柠檬酸，异柠檬酸氧化脱羧将NAD+ 还原生成NADH，导致340nm处光吸收上升。
组成：
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产品名称
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KC019-100T/96S
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Storage
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试剂一：液体
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100ml
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-20℃
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试剂二：液体
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20ml
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-20℃
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试剂三：液体
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1.5ml
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-20℃
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试剂四：液体
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20ml
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4℃
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试剂五：液体
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5ml
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4℃
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试剂六：粉剂
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1支
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-20℃
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试剂七：粉剂
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1支
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4℃
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说明书
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一份
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试剂六：粉剂×1支，-20℃保存；临用前加1.5ml蒸馏水充分溶解；现配现用
试剂七：粉剂×1支，4°保存；临用前加12ml试剂四充分溶解；
工作液：临用前在12ml试剂七中加入1ml蒸馏水、1ml试剂四、1ml试剂五、1ml试剂六充分混匀
自备仪器和用品：
紫外分光光度计/酶标仪、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研钵、冰和蒸馏水。
样本的前处理：
组织、细菌或细胞中胞浆蛋白与线粒体蛋白的分离：
1、 称取约0.1g组织或收集500万细胞，加入1ml试剂一和10μl 试剂三，用冰浴匀浆器或研钵匀浆。
2、 将匀浆转入离心管内600g，4℃离心5min。
3、 弃沉淀，将上清液移至另一离心管中，11000g，4℃离心10min。
4、 上清液即胞浆提取物，可用于测定胞质顺乌头酸酶活性。
5、 在步骤④的沉淀中加入200μl试剂二和2μl 试剂三，超声波破碎（冰浴，功率20％或200W，超声3秒，间隔10秒，重复30次），用于线粒体顺乌头酸酶活性测定。
测定步骤：
1、 分光光度计或酶标仪预热30min以上，调节波长至340nm，蒸馏水调零。
2、 样本测定
（1）将工作液，置于37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）水浴10min；现配现用；若分次用将工作液分装后于-20°保存，一星期内可用。
（3）在微量石英比色皿或96孔板中加入40μl样本160μl工作液，混匀，立即记录340nm处20s时的吸光值A1和 3min20s后的吸光值A2，计算ΔA=A2-A1。
ACO活性计算：
a.用微量石英比色皿测定的计算公式如下
（1） 按样本蛋白浓度计算
单位的定义：每mg组织蛋白每分钟生成1 nmol的NADH定义为一个酶活性单位。
ACO活性（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷(Cpr×V样) ÷T=268×ΔA÷Cpr
（2） 按样本鲜重计算
单位的定义：每g组织每分钟生成1 nmol的NADH定义为一个酶活性单位。
ACO（nmol/min/g 鲜重）＝[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷(W ×V样÷V样总) ÷T=54×ΔA÷W
（3） 按细菌或细胞密度计算
单位的定义：每1万个细菌或细胞每分钟生成1 nmol的NADH定义为一个酶活性单位。
ACO活性（nmol/min/104 cell）＝[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷(500×V样÷V样总)÷T=0.108×ΔA
V反总：反应体系总体积，2×10-4 L；ε：NADH摩尔消光系数，6.22×103 L / mol /cm；d：比色皿光径，1cm；V样：加入样本体积，0.04 ml；V样总：加入提取液体积，0.202 ml；T：反应时间，3min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/ml；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500万。
b.用96孔板测定的计算公式如下
（1） 按样本蛋白浓度计算
单位的定义：每mg组织蛋白每分钟生成1 nmol的NADH定义为一个酶活性单位。
ACO活性（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷(V样×Cpr) ÷T=536×ΔA÷Cpr
（2） 按样本鲜重计算
单位的定义：每g组织每分钟生成1 nmol的NADH定义为一个酶活性单位。
ACO（nmol/min/g 鲜重）＝[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷(W× V样÷V样总)÷T=108×ΔA÷W
（3） 按细菌或细胞密度计算
单位的定义：每1万个细菌或细胞在反应体系中每分钟生成1 nmol的NADH定义为一个酶活性单位。
ACO活性（nmol/min/104 cell）＝[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷(500×V样÷V样总) ÷T=0.216×ΔA
V反总：反应体系总体积，2×10-4 L；ε：NADH摩尔消光系数，6.22×103 L / mol /cm；d：96孔板光径，0.5cm；V样：加入样本体积，0.04 ml；V样总：加入提取液体积，0.202 ml；T：反应时间，3min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/ml；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500万。
