线粒体异柠檬酸脱氢酶（ICDHm）活性测定试剂盒说明书
分光光度法 50管/48样
正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定
测定意义：
ICDHm（EC 1.1.1.41）广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞的线粒体中，在三羧酸循中催化异柠檬酸生成α-酮戊二酸，同时将NAD+ 还原为NADH，是三羧酸循环的限速酶之一，其催化的反应是细胞NADH主要来源之一。
测定原理：
ICDHm催化NAD+ 还原生成NADH，导致340nm处光吸收上升。
组成：
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产品名称
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KC007-50T/48S
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Storage
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试剂一：液体
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50ml
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-20℃
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试剂二：液体
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10ml
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-20℃
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试剂三：液体
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1ml
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-20℃
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试剂四：液体
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60ml
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4℃
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试剂五：粉剂
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1支
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4℃
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试剂六：粉剂
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1支
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-20℃
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试剂七：粉剂
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1支
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-20℃
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说明书
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一份
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试剂七：粉剂×1支，-20℃保存; 临用前加入3ml蒸馏水充分混匀待用；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。
工作液的配制：临用前把试剂五、试剂六转移到试剂四中混合溶解待用；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。
样本的前处理：
组织、细菌或细胞中胞浆蛋白与线粒体蛋白的分离：
1、 称取约0.1g组织或收集500万细菌或细胞，加入1ml试剂一和10μl 试剂三，用冰浴匀浆器或研钵匀浆。
2、 将匀浆600g，4℃离心5min。
3、 弃沉淀，将上清液移至另一离心管中，11000g，4℃离心10min。
4、 上清液即胞浆提取物，可用于测定从线粒体泄漏的ICDHm（此步可选做）。
5、 在步骤④的沉淀中加入200μl试剂二和2μl 试剂三，超声波破碎（冰浴，功率20％或200W，超声3秒，间隔10秒，重复30次），用于线粒体ICDHm活性测定。
测定步骤：
1、 分光光度计预热30min以上，调节波长至340nm处，蒸馏水调零。
2、 工作液于 37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）孵育5min。
3、 在1ml石英比色皿中依次加入60μl试剂七、80μl样本和1ml工作液，混匀，立即记录340nm处20s时的吸光值A1和2min20s时的吸光值A2，计算ΔA=A2-A1。
ICDHm活性计算：
（1） 按样本蛋白浓度计算
单位的定义：每mg组织蛋白每分钟生成1 nmol的NADH定义为一个酶活性单位。
ICDHm活性（nmol/min /mg prot）＝[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷(Cpr×V样) ÷T=1145×ΔA÷Cpr
（2） 按样本鲜重计算
单位的定义：每g组织每分钟生成1 nmol的NADH定义为一个酶活性单位。
ICDHm（nmol/min /g 鲜重）＝[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷(W ×V样÷V样总) ÷T=231.3×ΔA÷W
（3） 按细菌或细胞密度计算
单位的定义：每1万个细菌或细胞每分钟生成1 nmol的NADH定义为一个酶活性单位。
ICDHm活性（nmol/min/104 cell）＝[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷(500×V样÷V样总)÷T=0.463×ΔA
V反总：反应体系总体积，1.14×10-3 L；ε：NADH摩尔消光系数，6.22×103L / mol /cm；d：比色皿光径，1cm；V样：加入样本体积，0.08 ml；V样总：加入提取液体积，0.202 ml；T：反应时间，2min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/ml；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500万。
