线粒体苹果酸脱氢酶（MDHm）试剂盒说明书
微量法 100管/96样
正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定
测定意义：
MDH （EC 1.1.1.37）广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，线粒体中MDH是TCA循环的关键酶之一，催化苹果酸形成草酰乙酸；相反，胞浆中MDH催化草酰乙酸形成苹果酸。草酰乙酸是重要的中间产物， 连接多条重要的代谢途径。因此，MDH在细胞多种生理活动中扮演着重要的角色，包括线粒体的能量代谢、 苹果酸-天冬氨酸穿梭系统、活性氧代谢和抗病性等。根据不同的辅酶特异性，MDH分为NAD-依赖的MDH和NADP-依赖的MDH，细菌中通常只含有NAD-MDH，在真核细胞中，NAD-MDH分布于细胞质和线粒体中。
测定原理：
MDHm催化NADH还原草酰乙酸生成苹果酸，导致340nm处光吸收下降。
组成：
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产品名称
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KC015-100T/96S
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Storage
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试剂一：液体
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100ml
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-20℃
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试剂二：液体
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20ml
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-20℃
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试剂三：液体
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1.5ml
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-20℃
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试剂四：液体
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20 ml
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4℃
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试剂五：粉剂
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1瓶
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-20℃
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说明书
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一份
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自备仪器和用品：
紫外分光光度计/酶标仪、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔板和蒸馏水。
样本测定的准备：
组织、细菌或细胞中胞浆蛋白与线粒体蛋白的分离：
1、 称取约0.1g组织或收集500万细胞，加入1ml试剂一和10μl 试剂三，用冰浴匀浆器或研钵匀浆。
2、 将匀浆液于600g，4℃离心5min。
3、 弃沉淀，将上清液移至另一离心管中，11000g，4℃离心10min。
4、 上清液即胞浆提取物，可用于测定从线粒体泄漏的MDH（此步可选做）。
5、 在步骤④的沉淀中加入200μl试剂二和2μl 试剂三，超声波破碎（冰浴，功率20％或200W，超声3秒，间隔10秒，重复30次），用于MDHm活性测定。
测定步骤：
1、 分光光度计或酶标仪预热30min以上，调节波长至340nm，蒸馏水调零。
2、检测工作液的配制：用时在试剂五中加入19ml试剂四和0.5ml蒸馏水，充分混匀待用；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。
3、测定前将检测工作液在37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）水浴10min以上。
4、在微量石英比色皿或96孔板中加入5μl样本和195μl工作液，混匀后立即记录340nm处20s时的吸光值A1和 1min20s后的吸光值A2，计算ΔA=A1-A2。
MDHm活力单位的计算：
a.用微量石英比色皿测定的计算公式如下
（1）按样本蛋白浓度计算：
单位的定义：每mg组织蛋白每分钟消耗1 nmol的NADH定义为一个酶活力单位。
MDHm（nmol/min/mg prot）=[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷(V样×Cpr) ÷T=6430×ΔA÷Cpr
（2）按样本鲜重计算：
单位的定义：每g组织每分钟消耗1 nmol的NADH定义为一个酶活力单位。
MDHm（nmol/min/g 鲜重）=[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷（W× V样÷V样总）÷T =1299×ΔA÷W
（3）按细菌或细胞密度计算：
单位的定义：每1万个细菌或细胞每分钟消耗1 nmol的NADH定义为一个酶活力单位。
MDHm（nmol/min/104 cell）=[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷（2000×V样÷V样总）÷T=0.65×ΔA
V反总：反应体系总体积，2×10-4 L；ε：NADH摩尔消光系数，6.22×103 L / mol /cm；d：比色皿光径，1cm；V样：加入样本体积，0.005 ml；V样总：加入提取液体积，0.202ml；T：反应时间，1 min；W：样本质量，g；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/ml；2000：细胞或细菌总数，2000万。
b.用96孔板测定的计算公式如下
（1）按样本蛋白浓度计算：
单位的定义：每mg组织蛋白每分钟消耗1 nmol的NADH定义为一个酶活力单位。
MDHm（nmol/min/mg prot）=[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷(V样×Cpr) ÷T=12860×ΔA÷Cpr
（2）按样本鲜重计算：
单位的定义：每g组织每分钟消耗1 nmol的NADH定义为一个酶活力单位。
MDHm（nmol/min/g 鲜重）=[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷（W× V样÷V样总）÷T =2598×ΔA÷W
（3）按细菌或细胞密度计算：
单位的定义：每1万个细菌或细胞每分钟消耗1 nmol的NADH定义为一个酶活力单位。
MDHm（nmol/min/104 cell）=[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷（2000×V样÷V样总）÷T=1.3×ΔA
V反总：反应体系总体积，2×10-4 L；ε：NADH摩尔消光系数，6.22×103 L / mol /cm；d：96孔板光径，0.5cm；V样：加入样本体积，0.005 ml；V样总：加入提取液体积，0.202 ml；T：反应时间，1 min；W：样本质量，g；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/ml；2000：细胞或细菌总数，2000万。
