测定意义:
AGP (EC 2.7.7.21)主要存在于植物中,催化葡萄糖-1-磷酸与ATP反应生成淀粉合成的直接前体ADPG,是植物淀粉生物合成的主要限速步骤。
测定原理:
AGP催化的逆向反应生成G1P,在反应体系中添加的磷酸己糖变位酶和6-磷酸葡萄糖脱氢酶依次催化生成6-磷酸葡萄糖酸和NADPH,340nm下测定NADPH增加速率,即可计算AGP活性。
腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(ADP-glucose pyrophosphorylase,AGP)活性测定试剂盒说明书
分光光度法
正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定
测定意义:
AGP (EC 2.7.7.21)主要存在于植物中,催化葡萄糖-1-磷酸与ATP反应生成淀粉合成的直接前体ADPG,是植物淀粉生物合成的主要限速步骤。
测定原理:
AGP催化的逆向反应生成G1P,在反应体系中添加的磷酸己糖变位酶和6-磷酸葡萄糖脱氢酶依次催化生成6-磷酸葡萄糖酸和NADPH,340nm下测定NADPH增加速率,即可计算AGP活性。
组成:
产品名称
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SA001-25T/24S
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SA001-50T/48S
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Storage
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提取液:液体
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25ml
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50ml
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4℃
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试剂一:液体
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20ml
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40ml
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4℃
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试剂二:粉剂
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1瓶
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1瓶
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4℃
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试剂三:粉剂
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1瓶
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1瓶
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-20℃
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说明书
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1份
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SA001-25T/24S试剂二临用前加入9ml蒸馏水充分溶解备用;用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融;
SA001-25T/24S试剂三临用前加入5ml蒸馏水充分溶解备用;用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融;
SA001-50T/48S试剂二临用前加入18ml蒸馏水充分溶解备用;用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融;
SA001-50T/48S试剂三临用前加入10ml蒸馏水充分溶解备用;用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融;
自备仪器和用品:
紫外分光光度计、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、1 ml石英比色皿、研钵、冰和蒸馏水
粗酶液制备:
按照组织质量(g):提取液体积(ml)为1:5~10的比例(建议称取约0.1g组织,加入1ml提取液),进行冰浴匀浆。10000g 4℃离心10min,取上清,置冰上待测。
测定步骤:
1、分光光度计预热30min以上,调节波长至340nm,蒸馏水调零。
2、试剂一置30℃保温10min以上。
3、在EP管中按顺序加入下列试剂
试剂名称(μl)
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测定管
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试剂一
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200
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试剂二
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320
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样本
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40
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混匀,30℃保温15 min,置沸水浴中1 min(盖紧,防止水分散失),冰浴迅速冷却后,4000g4℃离心5min,取上清液,在1ml石英比色皿中依次加入下列试剂
混匀后,立即于340 nm波长下记录初始吸光度A1和 2min后的吸光度A2,计算ΔA=A2-A1。
AGP活性计算:
1、按样本蛋白蛋白浓度计算
单位的定义:每mg组织蛋白每分钟催化产生1nmol NADPH定义为一个酶活性单位。
AGP(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(V样×Cpr) ÷T×稀释倍数
=2813×ΔA÷Cpr
此法需要自行测定样本蛋白质浓度。
2、按照样本鲜重计算
单位的定义:每g组织每分钟催化产生1nmol NADPH定义为一个酶活力单位。
AGP(nmol/min /g 鲜重)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(W×V样÷V样总)÷T×稀释倍数
=2813×ΔA÷W
V反总:反应体系总体积,1×10-3 L;ε:NADPH摩尔消光系数,6.22×103 L / mol /cm;d:比色皿光径,1cm;V样:加入样本体积,0.04ml;V样总:加入提取液体积,1 ml;T:反应时间,2 min;稀释倍数:1.4;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/ml;W:样本质量。