淀粉脱分支酶(Starch debranching enzyme,DBE)试剂盒说明书
分光光度法50管/24样
正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定
测定意义:
DBE能够专一性地裂解支链淀粉的α-1,6糖苷键,产生线性的葡萄糖链,在调整支链淀粉分子的链长方面有重要的作用。
测定原理:
采用3,5-二硝基水杨酸法测定DBE催化支链淀粉产生的还原糖,通过测定还原糖含量的变化来计算DBE活性。
组成:
产品名称
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SA019-50T/24S
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Storage
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提取液:液体
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60ml
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4℃
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试剂一:液体
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15ml
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4℃
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试剂二:粉剂
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1支
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4℃
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试剂三:液体
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12ml
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4℃
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试剂四:液体
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35ml
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4℃
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说明书
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1份
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试剂二临用前每支加入6ml试剂一,充分混匀后备用;用不完的试剂4℃保存;
自备仪器和用品:
可见分光光度计、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、1ml玻璃比色皿、研钵、冰、蒸馏水
粗酶液制备:
按照组织质量(g):提取液体积(ml)为1:5~10的比例(建议称取约0.1g组织,加入1ml提取液),进行冰浴匀浆。15000g 4℃离心10min,取上清,置冰上待测。
测定步骤:
1、分光光度计或酶标仪预热30min以上,调节波长到540 nm,蒸馏水调零。
2、加样表
试剂名称(μl)
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对照管
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测定管
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95℃水浴5min后灭活的样本
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200
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粗酶液
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200
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试剂一
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200
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试剂二
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200
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混匀,37℃准确保温2h
混匀,95℃水浴5min,于1ml玻璃比色皿540nm处读取各管吸光值。ΔA=A测定-A对照。每个测定管需设个一个对照管。
注意:可以在不同对照管中加入不同样品的粗酶液,然后集中进行5min 95℃沸水浴处理。
DBE活力单位的计算:
标准条件测定回归方程为y = 3.8458x - 0.165;x为标准品浓度(mg/ml),y为吸光值。
(1)按照蛋白浓度计算
单位的定义:每mg组织蛋白每h催化产生1mg 葡萄糖定义为一个酶活力单位。
DBE活力(mg /min /mg prot)=[ (ΔA+0.165)÷3.8458×V反总]÷(V样×Cpr)÷T
=0.26× (ΔA+0.165) ÷Cpr
(2)按样本鲜重计算
单位的定义:每g组织每分钟催化产生1mg 葡萄糖定义为一个酶活力单位。
DBE活力(mg /min /g鲜重)=[ (ΔA+0.165)÷3.8458×V反总]÷(W× V样÷V样总)÷T
=0.26× (ΔA+0.165) ÷W
V反总:反应体系总体积,0.4ml; V样:加入样本体积,0.2ml;V样总:加入提取液体积,1 ml;T:反应时间,2 h;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/ml;W:样本质量,g。
标准曲线线性范围为0.1mg/ml-1mg/ml。
ΔA线性范围为0.01-2。