β-淀粉酶（β-amylase，β-AL）试剂盒
（ 微量法100T/48S）
正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定
测定意义：
淀粉酶负责水解淀粉，主要包括α-淀粉酶和β-淀粉酶。β-淀粉酶(EC 3.2.1.2)可随机地作用于淀粉中的α-1,4-糖苷键，生成葡萄糖、麦芽糖、麦芽三糖、糊精等还原糖。
测定原理：
还原糖还原3,5-二硝基水杨酸生成棕红色物质。α-淀粉酶不耐酸，β-淀粉酶不耐热。根据上述特性，钝化其中之一，就可测出另一种淀粉酶的活力。
组成：
|
组分名称
|
SA012-100T/48S
|
Storage
|
|
试剂一
|
30ml
|
RT
|
|
试剂二
|
15ml
|
4℃
|
|
说明书
|
一份
|
试剂一：30ml×1瓶，常温保存，若有黄色晶体析出，需90℃加热溶解后再用；
试剂二：15ml×1瓶，4℃保存，若出现沉淀析出，需70℃加热溶解后再用。
自备仪器和用品：
可见分光光度计/酶标仪、恒温水浴锅、离心机、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研钵和蒸馏水。
粗酶液提取
组织：称取0.1~0.2g样本（建议称取约0.1g样本），加入1ml蒸馏水，研磨匀浆；将匀浆倒入离心管中，提取液在室温下放置提取15min，每5min振荡1次，使其充分提取；3000g，25℃离心10min，取上清液加蒸馏水定容至10 ml，摇匀，即淀粉酶原液。
吸取上述淀粉酶原液1ml，加入4ml蒸馏水，摇匀，即为淀粉酶稀释液，用于（α＋β）淀粉酶总活力的测定。
血清（浆）等液体样本：（1）直接检测α-淀粉酶。（2）吸取淀粉酶原液1ml，加入4ml蒸馏水，摇匀，即为淀粉酶稀释液，用于（α＋β）淀粉酶总活力的测定。
测定步骤：
1、分光光度计或酶标仪预热30min以上，调节波长到540 nm，蒸馏水调零。
2、试剂一和试剂二40℃预热10min.
3、测定操作表：
|
试剂名称（μl）
|
α 淀粉酶活力测定
|
总淀粉酶活力测定
|
|
对照管
|
测定管
|
对照管
|
测定管
|
|
淀粉酶原液
|
75
|
75
|
|
|
70℃水浴15min左右，冷却
|
淀粉酶稀释液
|
|
|
75
|
75
|
|
蒸馏水
|
75
|
|
75
|
|
|
试剂二
|
|
75
|
|
75
|
40℃恒温水浴中准确保温5min
混匀，95度水浴5min，冷却，取200μl 至微量石英比色皿或96孔板中，540nm处读取吸光值，从左到右分别记为A1、A2、A3和A4。每个测定管需设一个对照管。
酶活性计算：
a.用微量石英比色皿测定的计算公式如下
1、标准条件下测定回归曲线为y=3.7215x -0.1778； x为标准品浓度（mg/ml），y为吸光值。
2、α 淀粉酶活性
（1）按照样本质量计算
单位定义：每g组织每分钟催化产生1mg还原糖定义为1个酶活力单位。
α 淀粉酶活性(mg/min/g鲜重)=[(A2-A1＋0.1778)÷3.7215×V反总]÷(W×V样÷V样总)÷T
=1.075×(A2-A1＋0.1778)÷W
（2）按照蛋白质含量计算
单位定义：每mg组织蛋白每分钟催化产生1mg还原糖定义为1个酶活性单位。
α 淀粉酶活性(mg/min/mg prot)= [(A2-A1＋0.1778)÷3.7215×V反总]÷（V样×Cpr）÷T
=0.1075×(A2-A1＋0.1778) ÷Cpr
（3）血清（浆）等液体样本中α 淀粉酶活性计算
单位定义：每ml血清（浆）每分钟催化产生1mg还原糖定义为1个酶活性单位。
α 淀粉酶活性(mg/min/ml)= [(A2-A1＋0.1778)÷3.7215×V反总]÷V样÷T=0.1075×(A2-A1＋0.1778)
3、总淀粉酶活性计算
（1）按照样品质量计算
单位定义：每g组织每分钟催化产生1mg还原糖定义为1个酶活力单位。
总淀粉酶活性(mg/min//g鲜重)=5×[(A4-A3＋0.1778)÷3.7215×V反总]÷(W×V样÷V样总)÷T=5.375×(A4-A3＋0.1778)÷W
（2）按照蛋白质含量计算
单位定义：每mg组织蛋白每分钟催化产生1mg还原糖定义为1个酶活力单位。
总淀粉酶活性(mg/min/mg prot)=5×[(A4-A3＋0.1778)÷3.7215×V反总]÷（V样×Cpr）÷T
=0.5375×(A4-A3＋0.1778) ÷Cpr
（3）血清（浆）等液体样本中总淀粉酶活性计算
单位定义：每ml血清（浆）每分钟催化产生1mg还原糖定义为1个酶活性单位。
总淀粉酶活性(mg/min/ml) =5×[(A4-A3＋0.1778)÷3.7215×V反总]÷V样÷T
=0.5375×(A4-A3＋0.1778)
4、β-淀粉酶活性计算
（1）按照样本质量计算
单位定义：每g组织在反应体系中每分钟催化产生1mg还原糖定义为1个酶活力单位。
β-淀粉酶活性(mg/min/g鲜重)=淀粉酶总活性-α-淀粉酶活性=[5.375×(A4-A3＋0.1778)-1.075×(A2-A1＋0.1778)]÷W
（2）按照蛋白质含量计算
单位定义：每mg组织蛋白每分钟催化产生1mg还原糖定义为1个酶活力单位。
β-淀粉酶活性（mg/min/mg prot）=淀粉酶总活性-α-淀粉酶活性=[0.5375×(A4-A3＋0.1778)-0.1075×(A2-A1＋0.1778)]÷Cpr
（3）血清（浆）等液体样本中β-淀粉酶活性计算
单位定义：每ml血清（浆）每分钟催化产生1mg还原糖定义为1个酶活性单位。
β-淀粉酶活性（mg/min/ml）=淀粉酶总活性-α-淀粉酶活性=0.5375×(A4-A3＋0.1778)-0.1075×(A2-A1＋0.1778)
5：总淀粉酶稀释倍数；V反总：反应体系总体积，0.15ml；V样：加入反应体系中样本体积，0.075 ml；V样总：提取液总体积，10 ml； Cpr：样本蛋白质浓度，mg/ml；W：样本质量，g；T：反应时间，5min。
b.用96孔板测定的计算公式如下
1、标准条件下测定回归曲线为y=2.481x -0.1778； x为标准品浓度（mg/ml），y为吸光值。
2、α 淀粉酶活性
（1）按照样本质量计算
单位定义：每g组织每分钟催化产生1mg还原糖定义为1个酶活力单位。
α 淀粉酶活性(mg/min/g鲜重)=[(ΔA＋0.1778)÷2.481×V反总]÷(W×V样÷V样总)÷T=1.612×(ΔA＋0.1778)÷W
（2）按照蛋白质含量计算
单位定义：每mg组织蛋白每分钟催化产生1mg还原糖定义为1个酶活性单位。
α 淀粉酶活性（mg/min/mg prot）=[(ΔA＋0.1778)÷2.481×V反总]÷（V样×Cpr）÷T =0.1612×(ΔA＋0.1778) ÷Cpr
（3）血清（浆）等液体样本中α 淀粉酶活性计算
单位定义：每ml血清（浆）每分钟催化产生1mg还原糖定义为1个酶活性单位。
α 淀粉酶活性（mg/min/ml）=[(ΔA＋0.1778)÷2.481×V反总]÷V样÷T =0.1612×(ΔA＋0.1778)
3、总淀粉酶活性计算
（1）按照样本质量计算
单位定义：每g组织每分钟催化产生1mg还原糖定义为1个酶活力单位。
总淀粉酶活性(mg/min/g鲜重)=5×[(A4-A3＋0.1778)÷2.481×V反总]÷(W×V样÷V样总)÷T
=8.06×(ΔA＋0.1778)÷W
（2）按照蛋白质含量计算
单位定义：每mg组织蛋白每分钟催化产生1mg还原糖定义为1个酶活力单位。
总淀粉酶活性(mg/min/mg prot)=5×[(A4-A3＋0.1778)÷2.481×V反总]÷（V样×Cpr）÷T
=0.806×(A4-A3＋0.1778) ÷Cpr
（3）血清（浆）等液体样本中总淀粉酶活性计算
单位定义：每ml血清（浆）每分钟催化产生1mg还原糖定义为1个酶活性单位。
总淀粉酶活性(mg/min/ml)=5×[(A4-A3＋0.1778)÷2.481×V反总]÷V样÷T
=0.806×(A4-A3＋0.1778)
4、β-淀粉酶活性计算
（1）按照样本质量计算
单位定义：每g组织在反应体系中每分钟催化产生1mg还原糖定义为1个酶活力单位。
β-淀粉酶活性(mg/min/g鲜重)=淀粉酶总活性-α-淀粉酶活性=[8.06×(A4-A3＋0.1778)-1.612×(A2-A1＋0.1778)]÷W
（2）按照蛋白质含量计算
单位定义：每mg组织蛋白每分钟催化产生1mg还原糖定义为1个酶活力单位。
β-淀粉酶活性（mg/min/mg prot）=淀粉酶总活性-α-淀粉酶活性=[0.806×(A4-A3＋0.1778)-0.1612×(A2-A1＋0.1778)]÷Cpr
（3）血清（浆）等液体样本中β-淀粉酶活性计算
单位定义：每ml血清（浆）每分钟催化产生1mg还原糖定义为1个酶活性单位。
β-淀粉酶活性（mg/min/ml）=淀粉酶总活性-α-淀粉酶活性=0.806×(A4-A3＋0.1778)-0.1612×(A2-A1＋0.1778)
5：总淀粉酶稀释倍数；V反总：反应体系总体积，0.15ml；V样：加入反应体系中样本体积，0.075 ml；V样总：提取液总体积，10 ml； Cpr：样本蛋白质浓度，mg/ml；W：样本质量，g；T：反应时间，5min。
